一种人脐带间充质干细胞的分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106399235A(43)申请公布日2017.02.15(21)申请号201610910565.2(22)申请日2016.10.19(71)申请人浙江译美生物科技有限公司地址310020浙江省杭州市江干区新塘路82号新业大厦10楼A区(72)发明人陈继冰吴振化(74)专利代理机构北京维正专利代理有限公司11508代理人林乐飞(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书2页说明书9页(54)发明名称一种人脐带间充质干细胞的分离方法(57)摘要本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离方法，该分离方法包括以下步骤：新生儿新鲜的离体脐带→低温PBS液保存、冲洗→低温浸泡液中剪切→低温PBS液冲洗，低温真空处理→解冻→加入PBS液浸润→加入第一混合酶溶液，振荡酶解处理→加入第二混合酶溶液，振荡酶解处理→加入胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入PBS液，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基，混匀，即得；具有提高产品品质的效果。CN106399235ACN106399235A权利要求书1/2页1.一种人脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；iii.在控温为2~5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10~20ml，所述浸泡液包括0.9~1.0g/L的葡萄糖、10~20g/L的乙醇，余量为水；iv.取剪切后的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2~3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80~-70℃且控真空度为10~30Pa的环境下5~20min，除去脐带上的溶剂；v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40~-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40~-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5~0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5~0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5~1ml，振荡1~5min使脐带和PBS液充分接触；vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-5min，15℃恒温→5.01-20min，匀速升温至25℃→20.01-30min，25℃恒温→30.01-40min，匀速升温至37℃→40.01-75min，37℃恒温→75.01-90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2~5ml，所述第一混合酶溶液包括1~2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2~3mg/g的胶原酶II、5~10mg/g的乙醇，余量为水；viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-2min，25℃恒温→2.01-10min，匀速升温至30℃→10.01-15min，30℃恒温→15.01-20min，匀速升温至37℃→20.01-60min，37℃恒温→60.01-75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2~5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5~1mg/g的胶原酶II、0.5~1mg/g透明质酸酶、0.2~0.5mg/g的DNA水解酶、2~5mg/g的乙醇，余量为水；IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.2~0.5ml:1~2ml:2~5ml；X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2~5ml；XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/