一组用于鸭源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106755382A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201611147225.5(22)申请日2016.12.13(71)申请人苏州百源基因技术有限公司地址215011江苏省苏州市苏州高新技术产业开发区科技城锦峰路8号(72)发明人车团结沈颂东(74)专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司11249代理人吕玉博(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表2页附图4页(54)发明名称一组用于鸭源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针(57)摘要本发明提供一组用于鸭源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'-CTACGGCTCCTACCTGTATAAAGAA-3'，下游引物：5'-GATGTATGGGAGGGCTGAAAAT-3'，探针：5'-CAACTGCCTTCGTAGGTTATGTCCTGC-3'，所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。本发明的引物和探针可对牛羊猪肉和植物油中的鸭源性含量进行定性、定量分析，对判断牛羊猪肉和植物油中鸭源性含量具有重要意义，在食品检测领域具有重要作用。CN106755382ACN106755382A权利要求书1/2页1.一组用于鸭源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'-CTACGGCTCCTACCTGTATAAAGAA-3'下游引物：5'-GATGTATGGGAGGGCTGAAAAT-3'探针：5'-CAACTGCCTTCGTAGGTTATGTCCTGC-3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。3.鸭源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为鸭源性的定性或定量检测试剂盒；其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将鸭源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有鸭源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鸭源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；作为进一步优选，所述鸭源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：上游引物：5'-CCTACTGGCTATGCACTACACC-3'下游引物：5'-CGAAGAATCGGGTTAGGGTT-3'；作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测鸭源性的试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。7.鸭源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，其特征在于：步骤如下：（1）制备标准品：将鸭源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有鸭源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鸭源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；（3）标准曲线绘制；（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行鸭源性的快速定量检测。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述鸭源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：2CN106755382A权利要求书2/2页上游引物为5'-CCTACTGGCTATGCACTACACC-3'；下游引物为5'-CGAAGAATCGGGTTAGGGTT-3'；作为优选，PCR扩增所述鸭源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min；作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为