梅花参的荧光PCR检测方法及其引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110699461A(43)申请公布日2020.01.17(21)申请号201910947886.3(22)申请日2019.09.30(71)申请人浙江省检验检疫科学技术研究院地址310000浙江省杭州市西湖区文三路2号(72)发明人张晓峰吴姗张明哲虞惠贞尹文秀张荃孙超(74)专利代理机构浙江千克知识产权代理有限公司33246代理人黎双华(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页(54)发明名称梅花参的荧光PCR检测方法及其引物和探针(57)摘要本发明涉及梅花参的实时荧光PCR检测方法。基于具有高度物种特异性的梅花参线粒体细胞色素氧化酶亚基I序列(GenBank:FJ589205.1)设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real-TimePCR的方法对梅花参进行物种鉴定。本方法由于其引物和探针具有较高的特异性和灵敏度，可用于鉴别深加工后海参制品的真伪。CN110699461ACN110699461A权利要求书1/1页1.用于检测梅花参的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：TA-F:GCTCAACCAGGATCCCTTCTTA-R:CCGGCTCCTCTTTCTACTCCTA-P：FAM-CCTTCCCCCGAATGAACAAC-Eclipse。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括内参照引物和探针，其序列分别是：18SrRNA-F：CCTGAGAAACGGCTACCAT18SrRNA-R：CGTGTCAGGATTGGGTAAT18SrRNA-P：FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-Eclips。3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的使用浓度比为：TA-F:TA-R:TA-P＝1:1:14.一种检测梅花参的PCR鉴定方法，包括如下步骤：(1)样本的预处理；(2)提取经(1)处理后的样本中的DNA；(3)利用引物TA-F和TA-R，以及探针TA-P对(2)中提取的DNA进行荧光PCR扩增；(4)种类的确定；其特征在于，所述引物和探针序列包括：TA-F:GCTCAACCAGGATCCCTTCTTA-R:CCGGCTCCTCTTTCTACTCCTA-P：FAM-CCTTCCCCCGAATGAACAAC-Eclipse。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的荧光PCR扩增条件为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；50个循环。6.根据权利要求4至5之一所述的方法，其特征在于，所述的方法最终的判定条件为：Ct值小于等于43时，结果为阳性，Ct值大于43时为阴性。2CN110699461A说明书1/9页梅花参的荧光PCR检测方法及其引物和探针技术领域[0001]本发明涉及梅花参(Thelenotaananas)的实时荧光PCR检测方法。使用TaqMan探针实时荧光PCR检测技术，对梅花参进行物种成分检测鉴定，属于生物技术领域。背景技术[0002]海参属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)动物，全球有海参1400余种，分别属于6个目，25个科，在中国分布的有140多种。但世界上可供食用的海参约40多种，中国海域产的约有20余种。但各种海参由于营养成分的不同，和一些重要的生物学活性物质(如海参多糖、多肽、海参皂苷等等)含量的不同，价格差异巨大。梅花参属于楯手目(Aspidochirotida)、刺参科(Stichopodidae)动物，是我国产的海参中除了仿刺参以外品质较高的海参种类，主要分布在太平洋西南部，我国主要产于南海的西沙群岛，也是该海域品质最好的一种海参。梅花参体大肉厚，背部肉刺大，每3-11个肉刺的基部相连呈梅花状，故称“梅花参”。[0003]不同海参种类间巨大的价格差异，以及干海参、盐渍海参、即食海参、冻干海参、海参胶囊及海参口服液等多种多样的销售形态，导致了市售海参中经常有鱼龙混杂、以次充好。传统的海参鉴别方法主要依赖海参的外部形态和解剖特征，如骨片特征和呼吸树的有无等等，但这往往需要鉴定人员丰富的经验。因此建立起分子鉴定方法，实现梅花参的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。发明内容[0004]本发明利用实时荧光PCR技术，对梅花参进行鉴定，以满足对海参产品售假现象的监管需求。本发明提供了一种对梅花参进行定性检测鉴定的方法，可用于海参制品真伪鉴别。[0005]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0006](1)样本DNA提取。取2g冷水发泡12h后的梅花参样品