用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针及其方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101948913A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101948913A(43)申请公布日2011.01.19(21)申请号201010218499.5C12N15/11(2006.01)(22)申请日2010.07.06(71)申请人王有福地址116001辽宁省大连市中山区人民路81号1909室申请人李鑫曹冬梅胡强(72)发明人王有福李鑫曹冬梅胡强(74)专利代理机构大连星海专利事务所21208代理人于忠晶(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表2页C12Q1/04(2006.01)附图1页(54)发明名称用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针及其方法(57)摘要本发明属于植物检疫技术领域，涉及用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针。用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，含有一条特异性循环探针和一对引物：（1）探针LSTProbe：5’-(FAM)ATTCTGACTGTA(Eclipse)-3’；（2）引物LSTPrimer-F：5’-ACTCTGACCGAGCAACGCC-3’；LSTPrimer-R：5’-GATAACGCTTGCCCCCTATG-3’；其中：方框内为RNA碱基。本发明通过大量的植原体及细菌ITS序列比对，设计了一套实时荧光PCRCycling探针及引物，其灵敏度达0.5pgl-1，可以快速准确的从样品中检测出梨衰退植原体，该方法操作简单，易于掌握，可广泛应用于实验室日常检测工作。CN109483ACCNN110194891301948916A权利要求书1/2页1.用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其特征是：含有一条特异性循环探针和一对引物：（1）探针LSTProbe：5’-(FAM)ATTCTGACTGTA(Eclipse)-3’（2）引物LSTPrimer-F：5’-ACTCTGACCGAGCAACGCC-3’LSTPrimer-R：5’-GATAACGCTTGCCCCCTATG-3’其中：方框内为RNA碱基。2.根据权利要求1所述的用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其特征是：其合成方法是：首先在基因库中搜集全部植原体及有代表性细菌的16srDNA核酸序列，采用DNASTAR软件进行序列比对，找出梨衰退植原体与其他植原体的基因差异位点，设计出实时荧光PCR循环探针及引物，并于生物公司合成。3.根据权利要求1所述的用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其特征是：其LSTProbe特异性验证：将梨衰退植原体、2种以上检疫性植原体及2种以上不同属的细菌DNA作为模板进行LSTProbe特异性验证，PCR反应体系：2×CycleavePCRReactionMix12.5μlCycleavePrimerMix（10uM）1μlCycleaveProbe（3uM）1μlDNA1μldH2O9.5μlTotal25μlPCR反应条件：预变性95℃10sec；变性95℃5sec，退火55℃10sec，延伸72℃15sec，45cycles；LSTProbe特异性验证通过后，即表明该引物及探针可应用于杏褪绿卷叶植原体的检测。4.根据权利要求3所述的用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其特征是：其特异性验证中提取梨衰退植原体样本DNA，先进行扩繁：采用植原体通用引物对R16mF2:5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3'，R16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATCGA-3'进行第一轮扩增，可得到大小为1700bp左右片段，然后用第二对引物R16F2:5'-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3'，R16R2:5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3'进行巢氏PCR扩增，将得到大小为1200bp左右片段；PCR扩增体系及条件如下：10×缓冲液（Buffer）2.5μl2.5mMdNTP2μl引物-F（10umol/L）2μl引物-R（10umol/L）2μl2UTaqDNA聚合酶0.2μl模板DNA2μl加入双蒸水至终体积为25μl；PCR反应条件为：94℃预变性6min；94℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存；将上述片段进行克隆，转化入质粒（T-载体），进行扩繁、测序，所得梨衰退质粒备用。5.根据权利要求3所述的用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其特征2CCNN110194891301948916A权利要求书2/2页是：所述特异性验证中不同菌属的DNA分别是取自下述5个菌属中的典型菌种：细菌黄单胞、细菌欧氏杆菌属、细菌