一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109085364A(43)申请公布日2018.12.25(21)申请号201810909046.3(22)申请日2018.08.10(71)申请人广东海大畜牧兽医研究院有限公司地址511400广东省广州市番禺区沙头街小平工业区福平路八街5号(72)发明人刘博奇李其昌陈善真陈克宏王贵平(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人郑莹(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N33/531(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页(54)发明名称一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒(57)摘要本发明公开了一种牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽，并将其定向耦联到非蛋白多聚体葡聚糖上，使用该耦联多肽可以实现牛流行热病毒中和抗体ELISA检测，显著提高了检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中具有经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。另外，本发明所展示的检测方法，包被抗原用量可减至10ng/mL、或1ng/孔，显著降低了包被抗原成本，有利于市场技术推广使用。CN109085364ACN109085364A权利要求书1/1页1.一种牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽，其特征在于：牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽为B1～B4中的任意一条，B1：IRYEEDEKFKPVNLNPHEKSQC(SEQIDNo.1)；B2：LQAHHNLAKDEHYNKIC(SEQIDNo.2)；B3：SFRSELNDKERLWEAPDC(SEQIDNo.3)；B4：FLTPCTINDSKTKGCPLKDITGT(SEQIDNo.4)。2.一种耦联多肽，其特征在于：耦联多肽由权利要求1所述的牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽与非蛋白多聚体耦联得到。3.根据权利要求2所述的耦联多肽，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：1)取牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽溶解，得到多肽溶液；2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；3)在非蛋白多聚体溶液中加入耦联剂，混合均匀；4)将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽耦联到非蛋白多聚体上；5)除去未参与结合的耦联剂，纯化，冻干，得到耦联多肽。4.根据权利要求2或3所述的耦联多肽，其特征在于：非蛋白多聚体为具有可耦联基团的非蛋白多聚体。5.根据权利要求4所述的耦联多肽，其特征在于：可耦联基团为氨基、羧基、巯基中的至少一种。6.根据权利要求5所述的耦联多肽，其特征在于：非蛋白多聚体为多糖、脂质体中的至少一种。7.根据权利要求6所述的耦联多肽，其特征在于：非蛋白多聚体为多糖葡糖胺。8.根据权利要求2或3所述的耦联多肽，其特征在于：耦联试剂为4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的至少一种。9.权利要求2所述的耦联多肽在牛流行热病毒中和抗体ELISA检测中的应用。10.一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中含有权利要求2所述的耦联多肽。2CN109085364A说明书1/4页一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒。背景技术[0002]牛流行热病是由牛流行热病毒(BovineEphemeralFeverVirus，BEFV)引起的牛和水牛的急性传染病，其特征是病牛突发高热、呼吸迫促、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、跛行甚至急性死亡。该病可导致奶牛产奶量急剧降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成了重大经济损失。[0003]根据多年流行病学观察，牛流行热病周期性由过去的10～20年流行一次，到近年来周期缩短至3～5年或6～8年，有的地方甚至更短，如广东省从70年代以后，它的流行周期缩短到每间隔1～2年就有一次流行，对牛流行热病的防控问题也更加严峻。[0004]目前世界各地对BEFV病毒疾病的诊断方法主要有：病毒分离、分子生物学诊断(RT－PCR)、间接免疫荧光试验(ILFT)、ELISA法抗体检测、中和试验(SN)等等。目前的诊断方法中，ELISA法抗体检测为非特异的混合多克隆抗体检测，因为ELISA包被抗原为全病毒抗原抑或为病毒的亚结构蛋白，其检测到的抗体为抗病毒蛋白不同免疫活性位点的混合抗体群。据报道，市场