检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110240635A(43)申请公布日2019.09.17(21)申请号201910496410.2(22)申请日2019.06.10(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人张安定成泽任海洋(74)专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司42104代理人王和平冯超(51)Int.Cl.C07K14/125(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒(57)摘要本发明公开一种检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒，该试剂盒通过筛选的新城疫病毒HN蛋白的多肽包被酶标板，通过检测样品中血清抗体与多肽的结合能力，借助于辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡Igγ的抗体，来检测血清中新城疫病毒抗体水平。该试剂盒检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型抗体、鸡传染性法氏囊病病毒抗体、鸡传染性支气管炎病毒抗体均为阴性。该试剂盒可检测血凝抑制(HI)效价大于或等于4log2的血清，符合临床血清检测灵敏度的要求。与血凝抑制方法同时检测临床血清时，其符合率高达98.7％。且操作简便，无特殊材料要求，结果判定客观性好，不受操作人员主观判定的影响。适合作为新城疫疫苗免疫后抗体水平检测和监测的工具。CN110240635ACN110240635A权利要求书1/2页1.一种检测新城疫病毒抗体的多肽，其特征在于：所述多肽为NDV-F、NDV-H1、NDV-H2、NDV-H3和NDV-H4中任意一种，其中，NDV-F的氨基酸序列为LNKLEESNRKLDKVN，如SEQIDNO.1所示；NDV-H1的氨基酸序列为SAVFDSTSRSRITRVSSSSTKAAYTTSTCFK，如SEQIDNO.2所示；NDV-H2的氨基酸序列为PDEQDYQIR，如SEQIDNO.3所示；NDV-H3的氨基酸序列为PDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRIQQAILS，如SEQIDNO.4所示；NDV-H4的氨基酸序列为RYNDTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRIQQAILS，如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述检测新城疫病毒抗体的多肽，其特征在于：所述多肽为NDV-H4，其氨基酸序列为RYNDTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRIQQAILS，如SEQIDNO.5所示。3.一种检测新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA检测试剂盒包含有与牛血清白蛋白偶联的多肽的酶标板。4.根据权利要求3所述检测新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：作为优选方案，所述ELISA检测试剂盒还包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡Igγ，血清稀释液，洗涤液，标准阳性对照，阴性对照，底物液A，底物液B和终止液。5.根据权利要求4所述检测新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液每升中含有KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Tween-200.5mL；所述封闭液：脱脂乳5g，加洗涤缓冲液至100mL；所述血清稀释液：牛血清白蛋白2g，脱脂乳5g，加洗涤缓冲液至100mL；所述酶标抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡Igγ使用血清稀释液稀释8000倍制备；所述底物液A：0.2MNa2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，加蒸馏水至50mL，使用前加入3％H2O2150μL；所述底物液B：0.2MNa2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，加蒸馏水至50mL，使用前加入2mg/mL的TMB乙醇溶液2.5mL；所述底物液：底物液A与底物液B等比例混匀，现配现用；所述终止液：2.5mL氢氟酸加到900mL注射用水中，并定容至1000mL；所述标准阳性对照：新城疫疫苗免疫SPF鸡制备的血清，其血凝抑制效价为10log2；所述阴性对照：一月龄SPF鸡采集的血清。6.一种检测新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒检测鸡血清中新城疫病毒抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)待测样品的准备：取动物全血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10min，收集上清；得到待测样品。2)各样品的稀释：a.待检样品的稀释：取待测样品，用样品稀释液按1:40稀释，并充分混匀；b.阴性血清的稀释：取1份阴性血清，用样品稀释液按1:40稀释，并充分混匀；c.标准阳性血清的稀释：取已知HI效价的1份NDV标准阳性血清，用样品稀释液按1：40～1：2560倍比稀释，充分混匀后依次加入至酶标板