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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109355431A(43)申请公布日2019.02.19(21)申请号201811382365.X(22)申请日2018.11.20(71)申请人金宇保灵生物药品有限公司地址010030内蒙古自治区呼和浩特市鄂尔多斯西街58号(72)发明人刘建奇陈君彦王艳杰王秀明张宸王云凌武瑾贤刘国英魏学峰关平原范秀丽(74)专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限公司11322代理人邹亮鲁兵(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书14页序列表2页附图5页(54)发明名称同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物和探针(57)摘要本发明涉及一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物和探针、检测试剂盒以及检测方法。该引物和探针基于牛流行热病毒序列自5’端第3413~3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847~1988位碱基作为检测序列设计得到。利用本发明的检测操作简便、特异性强、灵敏度高,将在牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的检测、毒株鉴定及疫苗生产中发挥作用。CN109355431ACN109355431A权利要求书1/2页1.一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物,其特征在于,所述引物基于牛流行热病毒序列自5’端第3413~3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847~1988位碱基作为检测序列设计得到。2.根据权利要求1所述的引物,其特征在于,用于检测牛流行热病毒的上游引物的核苷酸序列如SEDIDNO:1所示或其衍生序列,用于检测牛流行热病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示或其衍生序列;用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物的核苷酸序列如SEDIDNO:3所示或其衍生序列,用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示或其衍生序列。3.一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的TaqMan探针,其特征在于,所述TaqMan探针基于牛流行热病毒序列自5’端第3413~3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847~1988位碱基作为检测序列设计得到。4.根据权利要求3所述的TaqMan探针,其特征在于,用于检测牛流行热病毒的TaqMan探针的核苷酸序列如SEDIDNO:5所示或其衍生序列,用于检测牛呼吸道合胞体病毒的TaqMan探针的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示或其衍生序列;所述探针经过荧光标记,其5’端标记有报告荧光基团,3’端标记有淬灭荧光基团。5.根据权利要求4所述的TaqMan探针,其特征在于,所述用于检测牛流行热病毒的TaqMan探针的报告荧光基团为FAM,荧光淬灭基团为TAMRA;所述用于检测牛呼吸道合胞体病毒的TaqMan探针的报告荧光基团为ROX,荧光淬灭基团为BHQ2;并且所述探针的3’端经磷酸化处理。6.一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包含权利要求1或2所述的引物和权利要求3或4所述的TaqMan探针。7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包含以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂:实时荧光定量PCR反应液2×OnestepRT-PCRBufferⅢ12.5μL,TaKaRaExTaqHS0.5μL,PrimeScriptRTEnzymeMIXⅡ0.5μL,用于检测牛流行热病毒的上游引物(10μM)1μL,用于检测牛流行热病毒的下游引物(10μM)1μL,用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物(10μM)1μL,用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物(10μM)1μL,用于检测牛流行热病毒的TaqMan探针(10μM)0.75μL,用于检测牛呼吸道合胞体病毒的TaqMan探针(10μM)0.5μL,RNA-freeH2O4.25μL。8.一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR检测方法,其包括使用权利要求1或2所述的引物和权利要求3或4所述的TaqMan探针、或权利要求5或6所述的检测试剂盒,对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行非诊断用途的定性、定量检测,其特征在于,包括以下步骤:1)建立标准曲线:分别构建携带牛流行热病毒的重组质粒和携带牛呼吸道合胞体病毒的重组质粒,制备DNA标准品,分别以10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝