猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT‑PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106521030A(43)申请公布日2017.03.22(21)申请号201611049405.XC12R1/93(2006.01)(22)申请日2016.11.25(71)申请人山东省动物疫病预防与控制中心地址250022山东省济南市槐荫区槐村街68号(72)发明人王贵升张鹤晓韦雪华田野李玉杰张月陈书民孙圣福陈静田夫林(74)专利代理机构济南泉城专利商标事务所37218代理人张菡(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表2页附图3页(54)发明名称猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法(57)摘要本发明涉及猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法，属于荧光定量RT-PCR技术领域。本发明的检测方法，使用两组引物和探针：第一组引物和探针的扩增产物的序列唯一与猪瘟病毒基因序列保守区一致，第二组引物和探针的扩增产物的序列唯一与BVDV基因序列保守区一致；另外，CSFV探针P仅出现在与猪瘟病毒基因序列保守区一致的扩增产物中，BVDV探针P仅出现在与牛病毒性腹泻病毒病毒基因序列保守区一致的扩增产物中（每组引物和探针能排除另外一组引物和探针的干扰）。因此，本发明的检测方法能够将CSFV与BVDV区分开来，且能够同时检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒。CN106521030ACN106521030A权利要求书1/2页1.一组荧光定量RT-PCR检测用引物和探针，其特征在于，由第一组引物和探针或/和第二组引物和探针组成；所述第一组引物和探针为：CSFV-F：ATACATAAAGCCCGGCCCTG，如SEQIDNO.1所示；CSFV-R：CTTGCCATCACTACCCGTGA，如SEQIDNO.2所示；CSFV探针P：FAM-CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC-BHQ1，如SEQIDNO.3所示；所述第二组引物和探针为：BVDV-F：AGCAACAGTGGTGAGTTCGT，如SEQIDNO.4所示；BVDV-R：CGTGGCATCTCGAGACCTTT，如SEQIDNO.5所示；BVDV探针P：HEX\VIC-ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA-BHQ1，如SEQIDNO.6所示。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，由第一组引物和探针、和第二组引物和探针组成。3.一种猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，含有权利要求2所述的引物和探针。4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，其组成为：DEPCH2O：2.75ul5×Buffer：2.5ul10×Buffer：1.25ul2.5mMdNTP：2ulCSFV-F:0.5ulCSFV-R:1ulCSFV探针P：0.5ulBVDV-F:0.5ulBVDV-R:1ulBVDV探针P：0.5ul20uMMgCl2：1.5ul酶混合物：1ul；所述CSFV-F、CSFV-R、CSFV探针P、BVDV-F、BVDV-R、BVDV探针P的浓度均为10μmol/L。5.一种猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求3或4所述检测试剂；将待测样品的核酸10ul与15ul检测试剂配成25ul的反应体系，然后进行荧光定量RT-PCR反应，读取结果；所述荧光定量RT-PCR反应：第一阶段：反转录42℃/30min；第二阶段：预变性94℃/3min；第三阶段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5个循环；第四阶段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40个循环；最后40℃/10sec；在第四阶段每次循环的退火56℃延伸时收集荧光；2CN106521030A权利要求书2/2页所述读取结果：如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于或等于30，则样品中含有CSFV；如果HEX\VIC检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于或等于30，则样品中含有BVDV。6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，用于扩增猪瘟病毒特异序列的引物和探针为：引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探针P；用于扩增牛病毒性腹泻病毒特异序列的的引物和探针为：BVDV-F、引物BVDV-R和BVDV探针P。3CN106521030A说明书1/6页猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法技术领域[0001]本发明涉及猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法，属于荧光定量RT-PCR技术领域。背景技术[0002]猪瘟病毒（C