一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114574466A(43)申请公布日2022.06.03(21)申请号202210495574.5C12P19/34(2006.01)(22)申请日2022.05.09(71)申请人翌圣生物科技（上海）股份有限公司地址201318上海市浦东新区天雄路166弄1号楼402室(72)发明人滕以刚袁灿灿王雪琪郭帅王小敏吴浩东柴常生惠丰(74)专利代理机构上海双诚知识产权代理事务所(普通合伙)31423专利代理师高利丹(51)Int.Cl.C12N9/16(2006.01)C12N9/10(2006.01)C12N9/12(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表9页附图8页(54)发明名称一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用(57)摘要本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。具体技术方案为：一种嵌合加帽酶，由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。本发明构建了一种新的嵌合加帽酶，与野生型加帽酶例如牛痘病毒加帽酶相比，具有更高的蛋白表达量、更简单的纯化方式、更优的酶活性以及更优的热稳定性，因此具有更广泛的应用前景。CN114574466ACN114574466A权利要求书1/1页1.一种嵌合加帽酶，其特征在于：由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。2.根据权利要求1所述嵌合加帽酶，其特征在于：所述其它单链加帽酶为非洲猪瘟病毒加帽酶、巨大病毒加帽酶或阿米巴病毒加帽酶中的任意一种。3.根据权利要求2所述嵌合加帽酶，其特征在于：所述其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域来自非洲猪瘟病毒来源的pNP868R或阿米巴病毒来源的D5b。4.一种嵌合加帽酶，其特征在于：其蛋白质序列如SEQIDNO.1所示。5.一种嵌合加帽酶，其特征在于：其蛋白质序列如SEQIDNO.2所示。6.一种嵌合加帽酶，其特征在于：其蛋白质序列如SEQIDNO.3所示。7.含有权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶的重组表达载体或重组细胞株。8.权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）制备所述嵌合加帽酶的重组表达载体，接种于2YT培养基中，培养，得到种子液；（2）取所得种子液接种于2YT培养基中，培养，得到菌液；（3）向所得菌液中加入IPTG至终浓度为0.1～0.5mM，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；（4）向所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，离心取上清液；（5）进行镍离子亲和层析，蛋白变性电泳检测各个洗脱峰，收集含有目的蛋白的样品，即获得所述的嵌合体。9.权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶在mRNA加帽中的应用。10.利用权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶制备的试剂、试纸或试剂盒。2CN114574466A说明书1/6页一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用技术领域[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。背景技术[0002]真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用，并且可以降低其在细胞内的免疫原性。因此，在许多治疗应用中，为mRNA加帽非常重要。[0003]加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其兼具RNA三磷酸酯酶活性（TPase）、鸟苷酰基转移酶活性（GTase）和鸟嘌呤甲基转移酶活性（MTase），可将7‑甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7GpppN，即Cap0结构）。[0004]目前mRNA的加帽途径主要有两种。第一是基于加帽酶的转录后修饰，此方法可以合成传统的帽子结构：m7GpppN（Cap0）、m7GpppNmpN（Cap1）和m7GpppNmpNm（Cap2）；由于帽子结构mRNA5’端没有游离的末端磷酸基团，所以可降低mRNA降解的风险。同时Cap1、Cap2mRNA后面两个核苷酸上的甲基分别封闭了磷酸酯键上游离的2’OH基团，因而对RNA酶A、T1、T2都很稳定。第二是在体外转录过程中添加帽类似物，比如抗‑反转帽类似物（ARCA）的帽类似物和加帽的二核苷酸，这种方法通常被称为“共转录加帽”。[0005]共转录加帽的方法更为通用、简便和便宜，并且可以将各种修饰的帽结构进行多样化设计。但此方法中有部分竞争性帽类似物会导致mRNA不完全加帽，同时部分帽类似物会反向定位到mRNA的末端。因此，与共转录加帽相比，利用加帽酶进行加帽的收率更高。[0006]目前主要使用的加帽酶为牛痘病毒加帽酶，其含有一个大亚基D1和一个小亚基D12。牛痘病毒加帽酶的表达纯化效率较