一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114409805A(43)申请公布日2022.04.29(21)申请号202210044776.8C12N15/62(2006.01)(22)申请日2022.01.14A61K39/00(2006.01)A61P35/00(2006.01)(66)本国优先权数据PCT/CN2021/0718952021.01.14CN(71)申请人北京门罗生物科技有限公司地址102206北京市昌平区沙河镇能源东路1号院1号楼6层1单元608-1(72)发明人王方圆戴卫国朱滨(74)专利代理机构北京预立生科知识产权代理有限公司11736代理人朱萍(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/85(2006.01)权利要求书3页说明书9页C12N5/10(2006.01)序列表4页附图2页(54)发明名称一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用。本发明基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，进而提高了CAR在细胞膜上的停留时间，增加了CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，可有效降低患者治疗后肿瘤的复发率，延长其生命周期，在临床上具有很好的应用价值。CN114409805ACN114409805A权利要求书1/3页1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；优选地，所述胞内结构域包括依次串联的共刺激信号传导区和CD3ζ胞内区；更优选地，所述CD3ζ胞内区为延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区；最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区为野生型CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸得到的；最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；更优选地，所述共刺激信号传导区包括CD27、CD28、4‑1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7‑H3和/或其任何组合的胞内区；最优选地，所述共刺激信号传导区为4‑1BB胞内区；最优选地，所述4‑1BB胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示；优选地，所述胞外结构域包括抗原识别区；更优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原包括CD3、CD19、CD123、CD138、CD38、CD33、CD30、CD28、CD27、CD22、CD20、IL13Rα2、CTLA4、CEA、CS1、NY‑ESO‑1、MAGEA3、ROR1、Her2、PD1、BCMA、GD2；最优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原为CD3；最优选地，所述抗原识别区包括与CD3特异性结合的scFv；最优选地，所述scFv由重链可变区‑Linker‑轻链可变区构成；最优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；最优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；最优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；更优选地，所述胞外结构域还包括信号肽和/或铰链区，形成依次串联的信号肽‑抗原识别区‑铰链区；最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；最优选地，所述铰链区包括CD8α、CD28、IgG1、IgG4、4‑1BB、PD‑1、CD34、OX40、CD3ε的铰链区；最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；最优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；优选地，所述跨膜结构域包括CD4、CD8、CD8α、CD28、H2‑Kb、OX40、4‑1BB的跨膜区；更优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜区；最优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、或病毒载体；更优选地，所述病毒载体包含慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。4.一种表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要2CN114409805A权利要求书2/3页求2所述的核酸分子，或权利要求3所述的表达载体；优选地，所述细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、或哺乳动物细胞；更优选地，所述细胞包括免疫细胞；最优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞