提高重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱产量的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106085941A(43)申请公布日2016.11.09(21)申请号201610475884.5(22)申请日2016.06.22(71)申请人安徽农业大学地址230036安徽省合肥市蜀山区长江西路130号(72)发明人张正竹李萌萌邓威威宁井铭邓骋(74)专利代理机构北京市京大律师事务所11321代理人刘向辉王凝(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/77(2006.01)C12P17/18(2006.01)C12R1/15(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表2页附图1页(54)发明名称提高重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱产量的方法(57)摘要本发明提供一种提高重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱产量的方法，以含有咖啡碱生物合成途径中关键酶基因CaXMT和TCS1的重组谷氨酸棒状杆菌作为发酵菌株，通过向发酵液中添加前体物质黄嘌呤核苷，并采用加压方式对重组菌细胞进行通透化处理，促进重组工程菌对底物黄嘌呤核苷的吸收，在表达的活性蛋白的催化作用下，使底物黄嘌呤核苷经过三次甲基化反应和一次核苷水解反应，最终生成咖啡碱。本发明通过改变细胞的通透性，促进底物的吸收，操作步骤简单、产品纯度高，为利用微生物工业化发酵生产咖啡碱奠定了理论基础。CN106085941ACN106085941A权利要求书1/1页1.重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述重组菌是通过将咖啡碱生物合成途径中的关键酶基因CaXMT和TCS1导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)构建而成的。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，基因CaXMT来源于咖啡果，基因TCS1来源于茶树。3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，其是将所述基因CaXMT和TCS1构建到同一穿梭表达载体pZ8-1上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中得到的重组菌。4.根据权利要求1-3任一项所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为ATCC13032。5.权利要求1-4任一项所述重组谷氨酸棒状杆菌在发酵生产咖啡碱中的应用。6.提高重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱产量的方法，其特征在于，以权利要求1-4任一项所述重组谷氨酸棒状杆菌作为发酵生产咖啡碱的菌株，在发酵培养过程中，向发酵液中添加一定浓度的黄嘌呤核苷，并采用加压方式对所述重组菌细胞进行通透化处理，促进重组菌对底物黄嘌呤核苷的吸收，从而提高咖啡碱的发酵产量。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞培养：活化重组菌菌株，接种到LB培养基中，30℃，200rpm条件下振荡培养12h，4℃离心收获菌体沉淀；菌体沉淀用不含碳源的发酵培养基CGXII清洗2～3次后，重悬于含有2％葡萄糖的CGXII培养基中，所得菌悬液的有效活菌数为106CFU/mL；2)添加底物：向上述菌悬液中添加一定浓度的黄嘌呤核苷，继续30℃，200rpm条件下振荡培养8h；3)细胞通透性处理：对上述发酵体系进行加压的细胞通透性处理，促进细胞对底物黄嘌呤核苷的吸收；4)酶催化反应：将步骤3)的发酵液继续30℃，200rpm条件下振荡培养120h，直至OD600nm值为3.2-3.6时，结束发酵。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)加压处理的条件为0.02-0.05Mpa处理1min。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所用培养基CGXII的配方为：(NH4)2SO420g/L，K2HPO41g/L，KH2PO410g/L，MgSO4·7H2O250mg/L，MOPS42g/L，尿素5g/L，维生素H0.2mg/L，硫胺素500μg/L，微量元素0.2mg/L，葡萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)向菌悬液中添加终浓度为0.1-1mg/mL的黄嘌呤核苷。2CN106085941A说明书1/4页提高重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱产量的方法技术领域[0001]本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及提高重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱产量的方法。背景技术[0002]咖啡碱即1,3,7-三甲基黄嘌呤，是风靡世界的三大软饮料植物(茶树、咖啡和可可)中嘌呤碱的主体成份。咖啡碱作为一种重要的植物次级代谢产物，具有抗菌、抵御生物入侵等生理作用。同时，咖啡碱对人体中枢神经系统有较强的兴奋作用，适量摄入能够改善思维活动，振奋神经，消除和抵抗疲劳，是重要的药物原料和饮料、食品添加剂。[0003]咖啡碱的制备方法主要包括化学合成法和生物技术法。随着人们对“绿色天然健康无公害”食品的不断推崇，利用微