一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896153A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202210544033.7C12P13/10(2006.01)(22)申请日2022.05.18C12R1/15(2006.01)(71)申请人江西农业大学地址330045江西省南昌市市辖区经济开发区志敏大道1101号(72)发明人张斌聂立斌盛琦许可心(74)专利代理机构江西省专利事务所36100专利代理师殷勇刚(51)Int.Cl.C12N15/77(2006.01)C12N15/67(2006.01)C12N15/64(2006.01)C12N15/61(2006.01)C12N15/31(2006.01)C12N15/53(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表3页附图8页(54)发明名称一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法(57)摘要本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L‑鸟氨酸产量的方法，包括如下步骤：(1)获得靶点基因qsuR和CGS9114_RS08985和pdxR；(2)构建重组质粒pK18‑Psod‑qsuR、pK18‑Psod‑CGS9114_RS08985和pK18‑T‑pdxR；(3)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16和MTL19；(4)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL21和MTL24；(5)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL25；(6)好氧发酵合成L‑鸟氨酸。本发明通过改造靶点基因，最终获得了具有最高L‑鸟氨酸产量的重组谷氨酸棒杆菌MTL25，进一步提高了L‑鸟氨酸的产量以及第三代生物质能源甘露醇的转化率。CN115896153ACN115896153A权利要求书1/2页1.一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L‑鸟氨酸产量的方法，包括如下步骤：(1)筛选遗传改造靶点基因：分别用葡萄糖和甘露醇为唯一碳源，对谷氨酸棒杆菌MTL01进行培养，收集对数期样本进行转录组分析，获得基因表达差异详情表进行深度挖掘，设定p＜0.05阈值，挑选显著上下调基因，同时结合差异表达基因相关代谢途径分析得到3个可能对L‑鸟氨酸产量有增益的靶点基因，包括2个显著上调基因qsuR和CGS9114_RS08985以及1个下调基因pdxR；(2)构建重组质粒pK18‑Psod‑qsuR、pK18‑Psod‑CGS9114_RS08985和pK18‑T‑pdxR：以谷氨酸棒杆菌S9114基因组为模板进行PCR，将强启动子Psod分别插入2个显著上调基因qsuR和CGS9114_RS08985上游的非编码区，分别构建含有融合片段Psod‑qsuR基因和Psod‑CGS9114_RS08985基因的重组质粒pK18‑Psod‑qsuR和pK18‑Psod‑CGS9114_RS08985；以谷氨酸棒杆菌S9114基因组为模板，通过PCR获得pdxR基因编码区插入T终止子的基因片段T‑pdxR，将其一步克隆至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB，构建含有T‑pdxR基因的重组质粒pK18‑T‑pdxR；(3)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16和MTL19：在谷氨酸棒杆菌MTL13基础之上，分别导入重组质粒pK18‑Psod‑qsuR、pK18‑Psod‑CGS9114_RS08985和pK18‑T‑pdxR，强化qsuR基因和CGS9114_RS08985基因的表达以及阻断基因pdxR的表达，得到重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16和MTL19；(4)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL21和MTL24：将重组质粒pK18‑Psod‑CGS9114_RS08985和pK18‑T‑pdxR分别导入重组谷氨酸棒杆菌MTL14，获得重组谷氨酸棒杆菌MTL21和MTL24；(5)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL25：将重组质粒pK18‑Psod‑CGS9114_RS08985导入重组谷氨酸棒杆菌MTL24，获得重组谷氨酸棒杆菌MTL25；(6)好氧发酵合成L‑鸟氨酸：将步骤(3)‑(6)中获得的重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16、MTL19、MTL21、MTL24和MTL25分别接种于鸟氨酸发酵培养基进行好氧发酵，6株重组谷氨酸棒杆菌分别按5‑20v/v％接种量接种于鸟氨酸发酵培养基，控制摇床转速为250rpm，温度为32℃，发酵时间为48‑72h，pH为6.8；所述鸟氨酸发酵培养基包括甘露醇、酵母粉、(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、FeSO4、MnSO4和CaCO3；发酵结束后收集发酵液，测定其发酵液上清中的鸟氨酸和甘露醇含量。2.如权利要求1所述利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L‑鸟氨酸产量的方法，其特