植物作为宿主在表达PD‑1抗体和/或PD‑L1抗体中的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107083398A(43)申请公布日2017.08.22(21)申请号201710458315.4(22)申请日2017.06.16(71)申请人深圳惠升生物科技有限公司地址518000广东省深圳市南山区粤海街道高新中一道生物孵化器大楼1-313(72)发明人王跃驹李文焦顺昌(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/13(2006.01)C07K16/28(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表8页附图4页(54)发明名称植物作为宿主在表达PD-1抗体和/或PD-L1抗体中的应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达PD-1抗体和/或PD-L1抗体中的应用。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达PD-1单克隆抗体(Keytruda，pembrolizumab)以及PD-L1单克隆抗体(Atezolizumab)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS-PAGE法确定重组PD-1以及PD-L1抗体成功表达。肺癌细胞抑制实验证明生菜生产的PD-1以及PD-L1抗体具有杀死癌细胞的生物学活性。CN107083398ACN107083398A权利要求书1/2页1.植物作为宿主在表达PD-1抗体和/或PD-L1抗体中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物选自生菜、烟草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。3.一种表达载体，其特征在于，包括以下各项中的任意一项以及载体：ⅰ.PD-1的重链序列或轻链序列；ⅱ.PD-L1的重链序列或轻链序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述PD-1的重链序列或轻链序列为将PD-1重链、PD-1轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的PD-1的重链序列或优化的PD-1的轻链序列；所述PD-L1的重链序列或轻链序列为将PD-L1重链、PD-L1轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的PD-L1的重链序列或优化的PD-L1的轻链序列。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述优化的PD-1的重链序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的PD-1的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的PD-1的轻链序列如SEQIDNo.3所示；所述优化的PD-1的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述优化的PD-L1的重链序列如SEQIDNo.5所示；所述优化的PD-L1的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述优化的PD-L1的轻链序列如SEQIDNo.7所示；所述优化的PD-L1的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。6.根据权利要求3至5任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。7.根据权利要求3至6任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将PD-1重链、PD-1轻链、PD-L1重链、PD-L1轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的PD-1的重链序列；ⅱ.优化的PD-1的轻链序列；ⅲ.优化的PD-L1的重链序列；iv.优化的PD-L1的轻链序列；步骤2：在所述优化的PD-1的重链序列或优化的PD-L1的重链序列或优化的PD-L1的轻链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Xhol位点；在所述优化的PD-1的轻链序列的5’末端加入Xmal限制性酶切位点，在3’末端加入Xhol位点；由genecript克隆到pUC57载体中，分别获得pPD-1H，pPD-1L，pPD-L1H或pPD-L1L克隆载体；步骤3：通过Kpnl/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-PD-1H，p35S-PD-1L，p35S-PD-L1H或p35S-PD-L1L。8.根据权利要求3至7任一项所述的表达载体在表达PD-1抗体和/或PD-L1抗体中的应用。9.一种植物作为宿主表达PD-1抗体和/或PD-L1抗体的方法，其特征在于，将如权利要求3至7任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，2CN107083398A权利要求书2/2页提取、分离蛋白质，获得PD-1抗体和/或PD-L1抗体。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3