植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110218257A(43)申请公布日2019.09.10(21)申请号201910549744.1(22)申请日2019.06.24(71)申请人王跃驹地址美国俄勒冈州，科瓦利斯市，威瑟姆希尔街道4410号2号公寓(72)发明人王跃驹马磊唐辉(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人刘颖(51)Int.Cl.C07K16/28(2006.01)C12N15/82(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表4页附图4页(54)发明名称植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达Antis15抗体的应用。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达Antis15抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用WesternBlot蛋白杂交法确定Antis15抗体成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出Antis15单抗。活性测试结果表明Antis15在小鼠模型上一直肿瘤生长效果与PD-1单抗持平。CN110218257ACN110218257A权利要求书1/1页1.植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括Antis15抗体的重链序列或轻链序列以及载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述Antis15抗体的重链序列或轻链序列为氨基酸序列，将Antis15抗体的重链、Antis15抗体的轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化Antis15抗体的重链序列或优化的Antis15抗体轻链序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的Antis15抗体的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的Antis15抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将Antis15抗体重链、Antis15抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的Antis15抗体的重链序列；ⅱ.优化的Antis15抗体的轻链序列；步骤2：在所述优化的Antis15抗体的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点；在所述优化的Antis15抗体的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入SacI位点；克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis15-H，pAntis15-L克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L。7.根据权利要求2至6任一项所述的表达载体在表达Antis15抗体中的应用。8.一种植物作为宿主表达Antis15抗体的方法，其特征在于，将如权利要求2至6任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得Antis15抗体。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；重复上述步骤2～3次，避光处理4d。2CN110218257A说明书1/8页植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。背景技术[0002]迄今为止，“谈癌色变”依旧是常态。大多数恶性肿瘤患者在确诊时已处于晚期，失去了手术机会，而肿瘤免疫逃逸的恶果始终难以遏制，导致肿瘤对许多传统疗法不敏感，预后不佳，因此，在很多人眼中“患癌”就是接到了“阎王令”。近年来，免疫疗法已经在癌症治疗上取得不小的成功，其中最有代表性的就是靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂。尽管如此，PD-1/PD-