一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108411042A(43)申请公布日2018.08.17(21)申请号201810496132.6(22)申请日2018.05.22(71)申请人天津农学院地址300384天津市西青区津静路22号(72)发明人张业尼孔庆学丁杨胡志新李万鹏于堃田茹(74)专利代理机构天津企兴智财知识产权代理有限公司12226代理人韩敏(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表1页附图2页(54)发明名称一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒(57)摘要本发明提供了一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒，引物包括上游引物1和下游引物1，其核苷酸序列如下所示：上游引物1：gggaaagggagaagtccatagcaat；下游引物1：tgagccagtagccttcacttcatag。本发明所述的试剂盒可以在加入TRIzol试剂将病毒灭活后在普通实验室进行检测，安全方便；对乙型脑炎病毒能定量检测，在病毒拷贝数在100以上时都能检测到，灵敏度高；可用于检测乙型脑炎病毒感染者的样品如血液、脑脊液中的病毒，也可用于乙型脑炎病毒的基础研究及疫苗研制、生产过程中病毒滴度的检测，具有良好的应用前景。CN108411042ACN108411042A权利要求书1/2页1.一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括上游引物1和下游引物1，其核苷酸序列如下所示：上游引物1：gggaaagggagaagtccatagcaat；下游引物1：tgagccagtagccttcacttcatag。2.一种包括权利要求1所述引物的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒。3.根据权利要求2所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、标准阳性DNA模版、逆转录反应液、荧光定量反应液。4.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准阳性DNA模版为含有乙型脑炎病毒NS5的基因序列的克隆质粒pGEM-NS5，所述乙型脑炎病毒NS5的基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。5.根据权利要求4所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述克隆质粒pGEM-NS5的制备方法包括如下步骤：S1.培养日本脑炎病毒，提取病毒RNA进行逆转录反应制备病毒cDNA，作为PCR反应模版；S2.利用上游引物2和下游引物2进行PCR反应，扩增NS5基因片段，上游引物2和下游引物2的核苷酸序列如下所示：上游引物2：gggaaagggagaagtccatagcaat；下游引物2：cagcagtattcgtgaaagtgttaag；S3.利用琼脂糖凝胶电泳纯化回收上述PCR反应产物，将其分别连接到克隆载体质粒pGEM-T上，构建重组质粒；S4.将重组质粒转化感受态细胞，挑阳性克隆培养，提取质粒，测序正确的克隆质粒命名为pGEM-NS5。6.根据权利要求5所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的克隆质粒pGEM-NS5的浓度分别为107拷贝数/μL、106拷贝数/μL、105拷贝数/μL、104拷贝数/μL或103拷贝数/μL。7.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述RNA抽提试剂为TRIzol；所述逆转录酶为SuperScriptIIIReverseTranscriptase。8.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述逆转录反应液包括1μLoligo(dT)20、4μL5×第一链缓冲液、1μL10mMdNTP混合液、1μL0.1MDTT。9.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光定量反应液包括1μL上游引物1、1μL下游引物1、25μLPlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDGwithROX。10.权利要求3-9所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，其特征在于：该使用方法包括如下步骤：S1.病毒RNA的提取：将BHK-21细胞接种病毒后培养，取细胞培养上清，加到RNA抽提试剂中，然后加入氯仿，震摇后离心取上层溶液，加入异丙醇，室温放置后离心，用75％乙醇洗RNA沉淀，离心后晾干，溶于DEPC处理的去离子水中得到RNA溶液；2CN108411042A权利要求书2/2页S2.逆转录反应：将逆转录反应液、RNA溶液、逆转录酶混匀进行逆转录反应得到逆转录产物；S3.荧光定