一种对新型内罗病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物、方法及试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116024390A(43)申请公布日2023.04.28(21)申请号202310177723.8C12N15/11(2006.01)(22)申请日2023.02.27(71)申请人成都大熊猫繁育研究基地地址610503四川省成都市成华区熊猫大道1375号申请人江苏大学(72)发明人刘颂蕊鲍思雯齐敦武张文侯蓉张洪文李运莉马锐岳婵娟范雪阳张东升(74)专利代理机构成都正德明志知识产权代理有限公司51360专利代理师张小娟(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)权利要求书1页说明书10页附图3页(54)发明名称一种对新型内罗病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物、方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种对新型内罗病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物、方法及试剂盒。引物具体序列如下：Nairo‑qPF：5’‑TGTGCCTTACAGGATTGCCTT‑3’；Nairo‑qPR：5’‑TCAAGGTTCTGTTGGTGCCA‑3’。本发明根据新型内罗病毒的S片段的基因序列设计并合成特异性引物，构建了重组质粒标准品，并建立了针对新型内罗病毒的实时荧光定量PCR检测体系，可实现新型内罗病毒的定量检测，对HSV等多种病毒无特异性扩增；能够检测到102copies/μL的重组质粒，是常规PCR的10000倍，具有特异性和敏感性高、重复性好及耗时短等优点。CN116024390ACN116024390A权利要求书1/1页1.一种对新型内罗病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，所述引物序列如下：Nairo‑qPF：5’‑TGTGCCTTACAGGATTGCCTT‑3’；Nairo‑qPR：5’‑TCAAGGTTCTGTTGGTGCCA‑3’。2.一种用于定量检测新型内罗病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物、TaqDNA聚合酶、阳性对照、阴性对照以及PCR反应预混液。3.一种利用权利要求1所述引物，或权利要求3所述试剂盒对新型内罗病毒进行实时荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计检测用引物Nairo‑qPF/R；(2)以新型内罗病毒RNA为模板进行逆转录得到病毒cDNA，采用引物Nairo‑qPF和Nairo‑qPR进行PCR扩增，回收PCR产物获得目的基因DNA片段，然后克隆并连接至感受态细胞中，筛选获得重组质粒标准品；(3)以重组质粒为模板，采用Nairo‑qPF和Nairo‑qPR进行实时荧光定量PCR获得标准曲线；(4)然后提取待测样本RNA，并采用Nairo‑qPF和Nairo‑qPR进行实时荧光定量PCR，再根据标准曲线计算待测样本中新型内罗病毒的含量。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中实时荧光定量PCR体系包括2×SYBRGreenⅠMix5μL，Nairo‑qPF(10μM)0.10μL，Nairo‑qPR(10μM)0.10μL，DNA模板1.00μL，无核酸酶水3.80μL，总体积为10.00μL。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s。2CN116024390A说明书1/10页一种对新型内罗病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物、方法及试剂盒技术领域[0001]本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种对新型内罗病毒STNV进行实时荧光定量PCR检测的引物及其试剂盒。背景技术[0002]内罗病毒(Nairoviridae)是布尼亚病毒目(Bunyavirales)下的一个病毒科，是一类分节段的负链RNA病毒。内罗病毒的基因组分为三个节段，分别为L(large)，M(middle)，S(small)片段，L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)帮助病毒的转录与复制，M片段编码病毒多聚糖蛋白前体，S片段编码核衣壳蛋白(NP)将病毒核酸包裹为核糖核蛋白复合物。内罗病毒科包含三个病毒属，分别为正内罗病毒属(Orthonairovirus)，Striwavirus和Shaspivirus，其中最为重要的是正内罗病毒属，包含15个病毒种，其余两个病毒属仅包含一种病毒。正内罗病毒属主要通过节肢类动物传播，可以引起人类和牲畜的严重疾病。节肢动物蜱能够携带多种病毒，蜱通过叮咬的方式将虫媒病毒传染给人类及某些动物，引起人畜发病情况，病情严重者甚至会导致人或者动物的死亡。例如，克里米亚‑刚果出血热病毒(Crimean‑Congohemorrhagicfevervirus，CCHFV,正内罗病毒属)又称新疆出血热病毒，是极重要的一种内罗病毒，其