基因克隆与表达的载体.pptx

会计学第三章基因克隆与表达的载体基因克隆过程在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。1.运送外源基因高效转入受体细胞
2.为外源基因提供复制能力或整合能力
3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
Withinthehostcellthevectormultiplies,producingnumerousidenticalcopiesnotonlyofitselfbutalsoofthegenethatitcarries.（2）在宿主细胞内能独立复制。
replicateindependentlyinhostcell复制位点

选择性标记

克隆位点基因工程中常用的载体有4类：第一节克隆载体大肠杆菌的质粒质粒的命名规则构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构（1）分子小：（二）质粒的一般生物学特性（4）质粒的空间构型：③线形DNA（linear，lDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率（三）质粒的基本性质2.不相容性（incompatibility）在大肠杆菌中的质粒，可以分为：如：F质粒（性质粒、或F因子）：大肠杆菌接合（conjunction）（2）非接合型质粒（non-conjugativeplasmid）带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因（1）如：分子量大，拷贝数低ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）2、质粒载体的构建：/（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数氨苄青霉素抗性（Ampr）
卡那霉素抗性（Kanr）
四环素抗性（Tetr）
链霉素抗性（Strr）
氯霉素抗性（Cmlr）常用抗生素的抗性原理ii）氯霉素（Chloramphenicol，Cml）iv）链霉素（Streptomycin，Str）②遗传标记/当带有抗生素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。4、人工构建的质粒载体的类型Plasmidamplification（2）低拷贝数的质粒载体（3）失控的质粒载体（4）插入失活型质粒载体（5）正选择的质粒载体（6）表达型质粒载体复制起始点ORI
选择标记
多克隆位点MCS质粒载体的选择（五）经典的大肠杆菌质粒载体6个克隆位点：
EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI
主要使用EcoRI。2.ColE1①colicinE1基因的结构EcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。复制位点

选择性标记

克隆位点严紧型：
松弛型：不相容性人工构建的质粒载体的类型人工构建的质粒载体的类型理想质粒载体应具备的条件经典的大肠杆菌质粒载体经典的大肠杆菌质粒载体pSP2124质粒的Ampr基因（5）pBR322的优点外源基因BamHI氯霉素扩增之后，每个细胞可达
1000~3000copy，达细胞DNA总量的40~50％（6）pBR322的缺点4.pUC系列①复制起点（2）长度pUC18/19Ampicillin抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。③lacZ的肽互补2）受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）pUC质粒载体上的lacZ’编码肽与受体菌缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。4）互补的插入失活④IPTG的诱导作用通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。无质粒的
受体菌（5）pUC系列载体的优点Promega公司的T载体系列Tvector的克隆过程－简便！（六）其它重要的质粒载体（六）其它质粒载体①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以体外转录mRNA3.穿梭质粒载体Yeast复制起点/（3）穿梭载体的优点（七）质粒载体的不稳定性有主动分配和随机分配两种假说。人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。4.结构的不稳定性（1）新陈代谢负荷：不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，称差度。质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差。
含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。蓝白斑筛选其它重要的质粒载体质粒分配方式影响质粒载体稳定性的主要因素二、噬菌体载体分为两种：2.溶源周期：噬菌体载体（一）双链噬菌体载体－载体DNA进入菌体后，形成双链环状DNA复制型（RFDNA）3.噬菌体作为构建载体材料的依据4.噬菌体载体的构建①去除非必需区，建立克隆或替换位点
②非必需区内插入选择