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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110568189A(43)申请公布日2019.12.13(21)申请号201910642182.5(22)申请日2019.07.16(71)申请人中国农业科学院特产研究所地址130112吉林省长春市净月经济开发区聚业大街4899号(72)发明人朱言柱闫喜军廉士珍(74)专利代理机构北京思元知识产权代理事务所(普通合伙)11598代理人余光军曾晖(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/558(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表1页附图3页(54)发明名称犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其应用。本发明利用pColdⅡ原核表达系统,制备具有良好反应原性的PB和Knob蛋白,对二者进行大量诱导表达,将复性后的两种蛋白分别作为包被抗原,与纯化的CAdV-1全病毒进行比对,最终确定Knob蛋白为最佳的ELISA包被抗原。在此基础上,本发明提供了一种高效、敏感性且特异性好的针对CAdV-1血清抗体的ELISA检测试剂盒,与SN法同时进行样品检测结果显示,本发明提供的ELISA检测试剂盒的敏感性为97.14%,特异性为90.00%,与SN符合率为93.57%,具有敏感度高,特异性好,重复性强等优点。CN110568189ACN110568189A权利要求书1/1页1.一种犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,包括包被抗原的ELISA板,酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液、终止液、标准CAdV-1阳性血清样品、标准CAdV-1阴性血清样品,其特征在于,所述的抗原是Knob蛋白。2.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述的Knob蛋白的制备方法包括:将Knob蛋白的编码基因通过原核表达系统在低温条件下表达,获得重组Knob蛋白。3.按照权利要求2所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,包括:(1)以提取的CAdV-1DNA作为模板,以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物扩增Knob全长基因;(2)将所扩增的Knob全长基因连接到原核表达载体后在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化,即得。4.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述酶标二抗为HRP标记的Goatanti-DogIgG。5.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述封闭液为BSA。6.按照权利要求5所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述封闭液为3%BSA。7.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,Knob蛋白包被ELISA板的浓度为2.5μg/mL。8.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述洗涤液是PBST。9.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述终止液为浓度为1M的HCL溶液。10.权利要求1-9任何一项所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒在制备检测犬腺病毒1型抗体的试剂中的应用。2CN110568189A说明书1/11页犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明涉及犬腺病毒1型抗体检测试剂盒,尤其涉及犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法,本发明进一步涉及犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒在检测犬腺病毒1型抗体中的应用,属于犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒领域。背景技术[0002]犬腺病毒1型(canineadenovirustype1,CAdV-1)是双链DNA病毒。CAdV-1主要引起肝炎、肾炎(犬)和脑炎(熊和狐),其致病性强、感染谱广,除感染犬和狐狸外,还能对野生肉食哺乳动物(狼、棕熊、黑熊、水獭)造成致死性感染(Jeong-Wonetal.,2014;Lepczyk,2015)。CAdV-1感染在世界各地均有报道,已引起广泛关注。CAdV-1病毒的监测需要特异性强、灵敏度高和准确性的检测方法。CAdV-1的传统检测方法,如病毒的分离与鉴定、SN、HA-HI等费时耗力,结果误差较大;PCR和qPCR虽然检测敏感性高,但在操作过程中极易造成环境中病毒核酸污染(Taskeretal.,2003)。[0003]ELISA作为传统的、应用最广的血清学诊断方法,其可操作性强,特异性和敏感性高且价格成本低,是CAdV-1疫苗免疫效果监测和感染动物的理想诊断方法。目前,CAdV-1抗体ELISA检测方法较多处于实验室研制阶段(姜莉莉等,2008;葛艳华等,2010;Walker