检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107102138A(43)申请公布日2017.08.29(21)申请号201710244673.5G01N21/78(2006.01)(22)申请日2017.04.14G01N21/31(2006.01)(71)申请人杨凌职业技术学院地址712100陕西省咸阳市杨凌区渭惠路24号申请人兴平市众和现代生态农牧有限公司(72)发明人张曼杨书会(74)专利代理机构北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司11385代理人董芙蓉(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/577(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表1页附图1页(54)发明名称检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用，涉及生物检测技术领域。本发明的ELISA试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、稀释液、底物显色液、兔抗鸡酶标二抗、终止液、FAVⅠ标准阳性血清和FAVⅠ标准阴性血清；其中，所述包被酶标板是以Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白作为包被抗原。本发明的ELISA试剂盒用于检测Ⅰ群禽腺病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，且该试剂盒操作简便、快速和成本低廉，适用于临床应用及推广。CN107102138ACN107102138A权利要求书1/2页1.一种检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、血清稀释液、底物显色液、兔抗鸡酶标二抗、终止液、FAVⅠ标准阳性血清和FAVⅠ标准阴性血清；其中，所述包被酶标板是以Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白作为包被抗原。2.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白的核苷酸序列表为SEQ.ID.No.1。3.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白的制备方法包括：设计合成引物，以Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ代表株鸡胚致死孤儿病毒基因组为模板，通过PCR扩增得到六邻体蛋白的扩增产物，所述扩增产物连接其表达载体并同时进行双酶切,然后连接，构建重组质粒；将挑选的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性重组质粒单克隆菌，所述阳性重组质粒单克隆菌在IPTG诱导下进行蛋白表达得到诱导产物，所述诱导产物依次经裂解沉淀、纯化及六阶段梯度复性后得到重组六邻体蛋白；其中，所述合成引物为：上游引物：5'-CGCGGATCCATGACTGCGCTTACTCCCGA-3'，下游引物：5'-CCGCTCGAGCCGCTCGAGCGCCAGCATGTACTGGTAAC-3'。4.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4。5.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述血清稀释液为含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。6.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述终止液为2M硫酸溶液。7.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述包被抗原的包被浓度为5.0μg/mL；所述包被酶标板经含50g/L脱脂奶粉的PBST封闭，装入密封袋中置于4℃保存。8.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述兔抗鸡酶标二抗的稀释倍数为1:5000。9.权利要求1-8任一项所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：用血清稀释液以体积比1：200的比例稀释待检血清得到稀释血清；向96孔酶标板每孔中加入100μ所述稀释血清，向酶标板各添加两孔FAVⅠ标准阳性血清和FAVⅠ标准阴性血清作为对照，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，再向每孔加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；向96孔酶标板每孔中加入100μL以体积比1:5000稀释后的兔抗鸡酶标二抗，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，向每孔中加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；向96孔酶标板每孔中加入100μL底物显色液，室温下避光作用10分钟；向96孔酶标板每孔加入100μL终止液以终止显色反应；2CN10710213