用于检测沙门氏菌和隐孢子虫的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114752594A(43)申请公布日2022.07.15(21)申请号202210549786.7C12R1/42(2006.01)(22)申请日2022.05.20C12R1/90(2006.01)(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人郭爱珍马耀争胡长敏陈颖钰朱杰陈曦陈建国(74)专利代理机构武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙)42231专利代理师徐绍新(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6893(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)权利要求书1页说明书11页序列表2页附图5页(54)发明名称用于检测沙门氏菌和隐孢子虫的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合(57)摘要本发明公开一种多重实时荧光定量PCR引物和探针组合，它由两组分别针对沙门氏菌InvA基因、隐孢子虫18SrRNA基因设计的引物和探针组成，本发明还公开了含有该引物和探针组合的试剂盒以及检测方法。本发明实现了沙门氏菌和隐孢子虫的双重实时荧光定量PCR检测，此方法快速、准确、特异性和灵敏性高，可以同时实现对沙门氏菌和隐孢子虫的定性和准确定量检测。CN114752594ACN114752594A权利要求书1/1页1.一种多重实时荧光定量PCR引物和探针组合，其特征在于由两组分别针对沙门氏菌InvA基因、隐孢子虫18SrRNA基因设计的引物和探针组成，各组引物和探针的核苷酸序列如下：第一组：上游引物序列如SEDIDNO:1所示，下游引物序列如SEQIDNO:2所示，探针序列如SEQIDNO:3所示；第二组：上游引物序列如SEDIDNO:4所示，下游引物序列如SEQIDNO:5所示，探针序列如SEQIDNO:6所示。2.如权利要求1所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合，其特征在于：所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。3.如权利要求2所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合，其特征在于，所述第一组探针的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；所述第二组探针的荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。4.权利要求1‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合在非诊断目的检测牛病原体中的应用，所述牛病原体是沙门氏菌和隐孢子虫。5.权利要求1‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合在制备检测牛病原体的试剂盒中的应用，所述牛病原体是沙门氏菌和隐孢子虫。6.一种检测牛病原体的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合。7.一种非诊断目的检测牛病原体的方法，所述牛病原体是沙门氏菌和隐孢子虫，其特征在于：包括向反应体系中加入权利要求1‑3任一项所述的引物和探针组合并进行多重实时荧光定量PCR扩增的步骤。8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系如下：2×T5FastqPCRMix12.5μL；第一组上、下游引物各1.1μL、探针0.9μL；第二组上、下游引物各0.8μL、探针1.1μL；模板DNA2μL；双蒸水补足至25μL。9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃30s，共42个循环。2CN114752594A说明书1/11页用于检测沙门氏菌和隐孢子虫的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合技术领域[0001]本发明属于分子检测领域，涉及一套用于检测沙门氏菌、隐孢子虫的引物和探针组合，本发明还涉及该引物和探针组合的应用。技术背景[0002]沙门氏菌可引起犊牛副伤寒，该病在国内外广泛存在，在我国呈现逐年增加的趋势。目前我国青海省、甘肃省等多地牧区都有沙门氏菌病大规模爆发的报道，感染牛和带菌牛都可作为该病的主要传播源，患牛可成为沙门氏菌的长期携带者。当牛本身的体质下降，抵抗力减弱时，就会发病，带菌牛通过排尿、排粪和流产等途径把细菌排出，污染周边环境。犊牛感染沙门氏菌后，多表现为肠炎型和中毒症状，其体温升高并伴随着恶臭黄色下痢，甚至出现黏液血液便，急性病例数日内即死于败血症，给养牛业造成巨大的经济损失。[0003]隐孢子虫(Cryptosporidium)是一类导致人和动物腹泻的寄生性原虫，造成犊牛腹泻的主要是微小隐孢子虫，由其引起的隐孢子病是一类人兽共患病。隐孢子虫拥有广阔的生存区域，可影响包括人在内的约二百四十余种哺乳动物，它们之间可经由水、食品、空气等各种渠道相互传染，隐孢子虫主要导致幼龄哺乳动物的消化系统和呼吸道疾病，并造成其生产性能降低甚至死亡。犊牛被隐孢子虫传染后，会出现高热、呕吐、腹泻等临床症状，并伴有水糊状的