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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106086221A(43)申请公布日2016.11.09(21)申请号201610709212.6(22)申请日2016.08.22(71)申请人浙江省农业科学院地址310021浙江省杭州市石桥路198号(72)发明人李锐袁玉伟杨华郝力力吉小凤钱鸣蓉肖英平(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表2页附图3页(54)发明名称基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒及应用(57)摘要本发明公开了一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的检测东方蜜蜂微孢子虫的试剂盒及应用,由无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品组成。荧光定量PCR反应液含有Real-timeProbePCRMix、ddH2O、检测用引物和探针。本发明试剂盒特异性强、灵敏度高、反应时间仅42分钟,非常适合对东方蜜蜂微孢子虫病的现场快速检测,可以在基层广泛推广。CN106086221ACN106086221A权利要求书1/1页1.一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测的引物和探针,其特征在于,所述引物和探针包括:东方蜜蜂微孢子虫上游引物和东方蜜蜂微孢子虫下游引物和东方蜜蜂微孢子探针,其中,所述东方蜜蜂微孢子虫上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述东方蜜蜂微孢子虫下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;所述东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB。2.权利要求1所述的引物和探针在制备东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒方面的应用。3.一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒,其特征在于,包括无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、阳性对照品和阴性对照品;所述荧光定量PCR反应液由Real-timeProbePCRMix、ddH2O、检测用引物和东方蜜蜂微孢子探针组成;所述检测用引物为东方蜜蜂微孢子虫上游引物和东方蜜蜂微孢子虫下游引物,所述东方蜜蜂微孢子虫上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述东方蜜蜂微孢子虫下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;所述东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB。4.根据权利要求3所述的基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒,其特征在于,阳性对照品为有东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的DNA样品,阴性对照品无东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的样品。5.根据权利要求3所述的基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒,其特征在于,所述的标准品为具有东方蜜蜂微孢子虫基因片段的重组质粒,该基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。6.根据权利要求3所述的基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒保存于-20℃下。2CN106086221A说明书1/4页基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域,具体地说,涉及一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒及应用。背景技术[0002]蜜蜂作为一种重要的授粉昆虫在维持农业可持续发展、农作物的多样性和提高农产品的质量与产量方面起着重要作用,仅蜜蜂授粉就可占英国农场总产值的19%,在美国所取得的经济效益高达12.5亿美元。但近年来美国、欧洲和中国等国家的蜂群出现了衰竭失调,蜜蜂蜂群出现明显下降趋势,其中东方蜜蜂微孢子虫是危害蜂群的主要病原物之一。该病原传播能力强,感染的寄主也广,它不仅感染东方蜜蜂、西方蜜蜂,而且感染熊蜂。被感染的蜂群越冬死亡率大大提高,产蜜量严重下降。[0003]目前现场诊断方法主要是在显微镜下检查蜜蜂肠道内容物,以确定是否感染微孢子虫。每群至少采集25只采集蜂,按每只蜂加l毫升水的比例加适量水,然后进行碾磨。把磨好的液体放在显微镜下观察,孢子沉降很快,磨好的液体搅拌后立即蘸取1滴进行观察。使用血球计确定感染水平,每只蜜蜂含百万个孢子时,一个视野中可观察到4-5只孢子。该方法灵敏性有限,而且最重要的是无法区分东方蜜蜂微孢子虫和西方蜜蜂微孢子虫(西方蜜蜂微孢子虫通常是相对良性的寄生虫