熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109234421A(43)申请公布日2019.01.18(21)申请号201811418108.7(22)申请日2018.11.26(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银黄嫦娇王武军邵碧英张志灯郑腾于师宇(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/6893(2018.01)C12Q1/686(2018.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图3页(54)发明名称熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明涉及熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于熊蜂微孢子虫的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌水。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对熊蜂微孢子虫的检测具有高度特异性，与其它微孢子虫和熊蜂病原物无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到20拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明试剂盒可用于熊蜂微孢子虫的检测及其与其他微孢子虫的鉴别诊断，对该病的早期预防和及时治疗具有重要意义。CN109234421ACN109234421A权利要求书1/1页1.一种熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物N.bombi-F、反向引物N.bombi-R及TaqMan探针N.bombi-P，各引物核苷酸序列如下：正向引物N.bombi-F：5’-GTCTCTCAGGCTCCTTCTCC-3’，反向引物N.bombi-R：5’-ATGTGCACCGCAGATAACTA-3’；TaqMan探针N.bombi-P：5’-ACCGTTACCCGTCACTGCCTTGT-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。2.根据权利要求1所述的一种熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括由下列试剂：（1）阳性标准品：100μL浓度为1×104拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（2）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用未感染熊蜂微孢子虫的健康熊蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR缓冲液625μL，浓度为10μmol/L的正向引物N.bombi-F和反向引物N.bombi-R各25μL，浓度为10μmol/L的TaqMan探针N.bombi-P25μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，共计825μL；-20℃保存；（4）ExTaq酶：25μL浓度为5U/μLExTaq酶1支，-20℃保存；（5）无菌水：2mL无菌水2支。3.利用权利要求1或2所述的熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液16.5μL，5U/μLExTaq酶0.5μL，待测样品DNA2.0μL，然后加入无菌水6.0μL，使反应总体积为25.0μL；（2）PCR反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性5s、60℃退火延伸30s，共40个循环，在60℃进行单点荧光检测；（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含熊蜂微孢子虫；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有熊蜂微孢子虫；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含熊蜂微孢子虫；重复检测结果有Ct值则该样品中含有熊蜂微孢子虫。2CN109234421A说明书1/5页熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种熊蜂微孢子虫实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物卫生技术领域，适用于熊蜂微孢子虫病的诊断和监测。背景技术[0002]熊蜂微孢子虫（Nosemabombi，简称N.bombi）是Fantham等首次从熊蜂身上分离出的1种微孢子虫，它主要危害熊蜂，是熊蜂最主要的病虫害之一。微孢子虫病也是目前熊蜂病害中最引人关注、研究最广的一种病，它既能感染蜂王，也可侵染工蜂成年蜂、幼虫和蛹，感染微孢子虫的熊蜂蜂群死亡率比正常情况下高出5倍。熊蜂被感染后逐渐衰弱，出现