SpRYn-ABE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114317589A(43)申请公布日2022.04.12(21)申请号202011055743.0(22)申请日2020.09.30(71)申请人北京市农林科学院地址100097北京市海淀区曙光花园中路9号(72)发明人杨进孝赵久然王飞鹏王瑶张成伟(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)权利要求书2页说明书14页序列表15页附图1页(54)发明名称SpRYn-ABE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用(57)摘要本发明公开了SpRYn‑ABE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用。本发明的SpRYn‑ABE碱基编辑系统包括SpRYn、腺嘌呤脱氨酶和esgRNA；所述esgRNA靶向靶点序列；所述esgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA‑esgRNA骨架(式I)。通过实验证明：本发明的SpRYn‑ABE碱基编辑系统可对位于植物基因组上的PAM序列为NAN或NCN或NTN的靶点序列中的碱基A进行编辑，实现碱基A到碱基G的替换，大大拓展了可编辑的A的范围。CN114317589ACN114317589A权利要求书1/2页1.一种将植物基因组靶点序列中的A突变为G的方法，为如下1)或2)：所述1)包括如下步骤：将SpRYn、腺嘌呤脱氨酶和sgRNA导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的A突变为G；所述2)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、腺嘌呤脱氨酶的编码基因和转录sgRNA的DNA分子导入植物体内，使所述SpRYn、所述腺嘌呤脱氨酶和所述sgRNA均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的A突变为G；所述sgRNA靶向靶点序列；所述靶点序列的PAM序列为NAN或NCN或NTN；N为A、T、C或G。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SpRYn为A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；A2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述腺嘌呤脱氨酶为ecTadA和ecTadA*；所述ecTadA为C1)或C2)或C3)：C1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；C2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述ecTadA*为E1)或E2)或E3)：E1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；E2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述sgRNA为esgRNA；所述esgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架(式I)；所述esgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：n1)将序列1第617-702位中的T替换为U得到的RNA分子；n2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述SpRYn的编码基因为b1)或b2)或b3)：b1)序列表中序列1第4132-8232位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述2CN114317589A权利要求书2/2页SpRYn的cDNA分子或DNA分子；所述ecTadA的编码基因为d1)或d2)或d3)：d1)序列表中序列1第2944-3441位所示的cDNA分子或DNA分子；d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或3中所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或3中所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；所述ecTadA*的编码基因为f1)或f2)或f3)：f1)序列表中序列1第3538-4035位所示的cDNA分子或DNA