一种基因碱基编辑器.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109021111A(43)申请公布日2018.12.18(21)申请号201810185384.7(22)申请日2018.03.07(66)本国优先权数据PCT/CN2018/0769912018.02.23CN(71)申请人上海科技大学地址200120上海市浦东新区华夏中路393号(72)发明人陈佳杨力黄行许杨贝王潇李佳楠(74)专利代理机构上海申汇专利代理有限公司31001代理人翁若莹(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12P19/30(2006.01)权利要求书2页说明书29页附图3页(54)发明名称一种基因碱基编辑器(57)摘要本发明提供的人源载脂蛋白B信使RNA脱氨酶催化亚基3A(APOBEC3A)、CRISPR相关Cas蛋白以及尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)[视情况而定加与不加]的融合表达的蛋白(碱基编辑器)。该碱基编辑器能够在DNA中进行碱基编辑，将胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，即使胞嘧啶位于GpC位点或者高甲基化状态下，该碱基编辑器仍然具有较高的编辑效率。CN109021111ACN109021111A权利要求书1/2页1.融合蛋白包括两个组分。第一个片段是人源载脂蛋白B信使RNA脱氨酶催化亚基3A(APOBEC3A)，第二个片段是CRISPR相关(Cas)蛋白-Cas9。2.权利要求1中的融合蛋白包含一个尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)。3.权利要求1中的融合蛋白的大小不超过2500个氨基酸。4.权利要求1中的融合蛋白中的APOBEC3A包含来自于SEQIDNO：1的氨基酸序列，或者与SEQIDNO：1的氨基酸残基的29-199位具有至少90％的序列同一性并保留胞苷脱氨酶活性。5.权利要求4中的融合蛋白中的APOBEC3A包含选自SEQIDNO：1-10的氨基酸序列。6.权利要求1中的融合蛋白中的Cas蛋白来自于以下组群SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpf1，LbCpf1，FnCpf1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9。7.权利要求1中的融合蛋白中的Cas蛋白是Cas蛋白组群(SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpf1，LbCpf1，FnCpf1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9)中某些蛋白的突变体，其保留了这些Cas蛋白的DNA结合活性，但不产生DNA双链断裂。8.权利要求7中的融合蛋白的组分Cas蛋白的突变体能够在其结合的DNA双链的一条链上引入一个缺口。9.权利要求7中的融合蛋白的组分Cas蛋白包含如SEQIDNO：11所示的氨基酸序列。10.在权利要求1融合蛋白中，第一片段位于第二片段的N端侧。11.权利要求2的融合蛋白的组分UGI包含如SEQIDNO：12所示的氨基酸序列，或者与SEQIDNO：12列出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性并保留尿嘧啶糖基化酶活性的功能。12.在权利要求11的融合蛋白中，第一片段位于第二片段的N端侧，第二片段位于UGI的N端侧。13.在权利要求1的融合蛋白中，第一片段与第二片段之间包含长短不一的连接肽。14.在权利要求13的融合蛋白中，该连接肽具有1至100个氨基酸残基。15.在权利要求13的融合蛋白中，该连接肽的氨基酸残基序列中至少有40％是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸，甘氨酸，半胱氨酸和丝氨酸。16.在权利要求13的融合蛋白中，该连接肽具有如SEQIDNO：13或14所示的氨基酸序列。17.权利要求1的融合蛋白，进一步包含核定位序列。18.权利要求1的融合蛋白，包括但不限于如SEQIDNO：16-20所示的那些氨基酸序列。19.权利要求1-18中任意一个编码融合蛋白的多聚核苷酸。20.权利要求提供的组合序列除包含了现公开实施例中所用碱基编辑器的编码核苷酸序列外，还包含了一个在生物医药领域内已被广泛承认和接受的承载载体。21.权利要求20进一步包含一个引导RNA(guideRNA)的序列。22.权利要求1-18，该发明还同时提供了使用该系列碱基编辑器(融合蛋白)和其相关组合物的方法。在该发明揭示的一个实施例中，其通过利用一种包含在该申请书中的碱基编辑器(融合蛋白)以及相应的引导RNA(guideRNA)将该碱基编辑器靶向定位到与guide2CN109021111A权利要求书2/2页RNA至少有部分序列互补性的基因组序列上，从而在目标位点有效地催化进行了胞嘧啶(C)脱氨基反应。23.权利要求22公开的实施方案中，胞嘧啶(