猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116024387A(43)申请公布日2023.04.28(21)申请号202211602247.1C12Q1/686(2018.01)(22)申请日2022.12.13C12R1/93(2006.01)(71)申请人江西正邦科技股份有限公司地址330008江西省南昌市高新技术开发区艾溪湖一路569号申请人江西正邦农业科学院厦门普康同创生物科技有限公司(72)发明人柳畅马玉文豪王炎焱肖敏潘廷云(74)专利代理机构南昌华成联合知识产权代理事务所(普通合伙)36126专利代理师黄晶(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒及其应用(57)摘要本申请涉及猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒及其应用，它包括PCR预混合液2×TaqPCRMasterMix以及用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和猪德尔塔冠状病毒四对特异性引物和探针构成的检测体系。本发明能够在同一时间快速、准确地对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和猪德尔塔冠状病毒进行检测，解决猪场检测中混合感染进行鉴别诊断费时费力的问题，有效降低猪场的经济损失。CN116024387ACN116024387A权利要求书1/2页1.一种猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR预混合液2×TaqPCRMasterMix以及用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和猪德尔塔冠状病毒四对特异性引物和探针构成的检测体系，其中：用于检测猪流行性腹泻病毒的引物PEDV‑F和PEDV‑R以及探针PEDV‑P的核苷酸序列如下：PEDV‑F：ctttcagcatccttatggctt；PEDV‑R：ccacaaccgratgctattraca；PEDV‑P：atgctgtggataatgta；用于检测猪传染性胃肠炎的引物TGEV‑F和TGEV‑R以及探针TGEV‑P的核苷酸序列如下：TGEV‑F：aggtgatgtgacaagattyta；TGEV‑R：araatgctrgacacagatgga；TGEV‑P：actgctcccattggcaa；用于检测猪轮状病毒A型的引物PDCov‑F和PDCov‑R以及探针PDCov‑P的核苷酸序列如下：PDCov‑F：agtagactccttgcagggayt；PDCov‑R：cttgccatgyttaacgactg；PDCov‑P：atgcacctccatgtacc；用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物PoRV‑F和PoRV‑R以及探针PoRV‑P的核苷酸序列如下：PoRV‑F：agargatattggaccwtctgatt；PoRV‑R：agcrtctgcatttgtcttaact；PoRV‑P：tggtgagtggatcgtt。2.根据权利要求1所述的一种猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，每25μL检测体系中包含12.5μLPCR预混合液2×TaqPCRMasterMix，用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和猪德尔塔冠状病毒四对特异性引物的浓度均为0.2μM，四种探针浓度均为0.05μM。3.根据权利要求1所述的一种猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述四对特异性引物和探针中序列5'端标记的荧光基团为FAM、VIC、CY5或ROX。4.根据权利要求1所述的一种猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述四对特异性引物和探针中序列3'端标记的基团为MGB。5.权利要求1~4任一权利要求所述的四重荧光PCR检测试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和猪德尔塔冠状病毒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：S100：获取待检测核酸样本；S200：将待检测核算样本加入所述四重荧光PCR检测试剂盒中进行检测，检测时每25μL检测体系中包含核酸样本5μL。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤S200中所述四重荧光PCR检测试剂盒的反应程序为：依次使得所述四重荧光PCR检测试剂盒在95℃下预变性1min、在60℃下反转录10min、在94℃下预变性2min、在94℃下变性15s以及在60℃下退火及延伸45s，进行2CN116024387A权利要求书2/2页45个循环，并在60℃下退火及延伸45s时收集FAM、VIC、Rox和Cy5荧光讯号。3CN116024387A说明书1/7页猪病毒性腹泻病原的四重荧光PCR检测试剂盒及其应用技