一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114839368A(43)申请公布日2022.08.02(21)申请号202210358533.1G01N27/447(2006.01)(22)申请日2022.04.06(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址201100上海市闵行区紫月路518号(72)发明人魏建超马志永孙卿张妍邱亚峰李蓓蓓李宗杰刘珂邵东华(74)专利代理机构台州浙粤垄专利代理事务所(普通合伙)33419专利代理师王洪臣(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/58(2006.01)C12N15/70(2006.01)C07K14/18(2006.01)权利要求书2页说明书17页序列表2页附图1页(54)发明名称一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒(57)摘要本发明提供一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒，属于病毒检测技术领域。鉴于现场检测过程中缺少快速检测GETV特异性抗体的方法，本发明建立一种盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是将合成的E2基因克隆至原核表达载体pColdI中构建重组质粒pColdI‑E2，通过对重组质粒pColdI‑E2进行IPTG低温诱导蛋白表达，然后包被纯化好的E2蛋白即可用于GETV特异性抗体的快速检测。实验证实，本发明制备得到的重组E2蛋白具有良好抗原性，所建立的间接ELISA抗体检测方法具有灵敏、特异、稳定的特点，非常适宜于GETV抗体的现场检测。CN114839368ACN114839368A权利要求书1/2页1.一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是以E2基因作为目的基因，采用人工直接合成抗原结构域进行原核表达制备得到重组E2抗原，以E2蛋白为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法。2.根据权利要求1所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的重组E2抗原的制备方法具体包括如下步骤：(1)将合成基因pUC57‑E2质粒和表达载体pColdⅠ(+)空载体进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，获得具有粘性末端的E2基因和pColdⅠ，依次将各组分加入灭菌EP管中，置37℃水浴锅中水浴5h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段；E2蛋白的编码氨基酸序列如SEQ.No:1所示，E2蛋白的氨基酸序列如SEQ.No:2所示；(2)鉴定正确的胶回收产物目的基因GETV‑E2和表达载体pColdⅠ用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，后将产物转化感受态细胞BL21，菌液均匀涂于含有氨苄霉素的LB琼脂平板进行培养；(3)阳性克隆质粒的酶切鉴定：挑取单菌落，使用含氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，37℃200rpm震荡10‑12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用EcoRI和XbaⅠ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，使用EcoRI单酶切克隆菌做阴性对照，双酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，将所含阳性条带的菌液进行测序；(4)IPTG诱导E2蛋白的表达：取测序正确的阳性菌液逐级接种到含氨苄霉素的LB肉汤培养基，37℃200rpm震荡过夜，至OD＝0.4‑0.6，加入5μl0.1mmol/LIPTG于18℃低温诱导过夜,即可诱导E2蛋白的表达。3.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中pUC57‑E2质粒酶切反应体系组成为pUC57‑E245μl，EcoRⅠ2μl，XbaI2μl，10×MBuffer10μl，ddH2O41μl；pColdⅠ(+)酶切反应体系组成为pColdⅠ(+)35μl，EcoRⅠ1μl，XbaⅠ1μl，10×MBuffer8μl，ddH2O35μl；步骤(2)中连接反应体系为GETV‑E24μl，pColdⅠ1μl，5×LigationBuffer2μl，T4DNALigase2μl，ddH2O1μl；步骤(3)中酶切反应体系组成为pColdI‑E25μl,EcoRI1μl，XbaI1μl，10×MBuffer2μl，DdH2O11μl。4.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，重组E2抗原在包被之前需进行分离纯化，其具体包括如下步骤：将菌液在转速条件为5000rpm下离心5min得到细菌沉淀，使用缓冲液吹散，置于在冰上超声破碎，离心后得到包涵体沉淀，使用含有尿素的缓冲液纯化含有重组E2抗原的包涵体，使用镍离子螯合层析柱纯化得到的重组E2抗原。5.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，使用碳酸盐缓冲液将重组E2蛋白稀释并包被，其具体包括如下步骤：向重组E2蛋白稀释中加入碳酸盐缓冲液，放入4℃冰箱过夜，弃去包被液，使用PBST洗涤