一种非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法、试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115032387A(43)申请公布日2022.09.09(21)申请号202210592515.XC07K1/22(2006.01)(22)申请日2022.05.27C12N15/34(2006.01)C12N15/70(2006.01)(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所C12N15/66(2006.01)地址201100上海市闵行区紫月路518号(72)发明人魏建超马志永杨扬李昱昊张妍管志欣张俊杰郑家杨邱亚峰李宗杰李蓓蓓刘珂邵东华(74)专利代理机构台州浙粤垄专利代理事务所(普通合伙)33419专利代理师王洪臣(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)C07K14/11(2006.01)权利要求书2页说明书14页序列表1页附图3页(54)发明名称一种非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法、试剂盒及其应用(57)摘要本发明属于生物检测技术领域，涉及一种非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法、试剂盒及其应用。本发明所建立的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其是通过原核表达制备ASFV重组pB602L蛋白，并以ASFV‑B602L蛋白作为待检抗原，建立ASFV间接ELISA抗体检测方法，为ASFV的检测和疾病的特异性诊断提供实验依据，获得特异性好，敏感性高的抗体诊断试剂盒。本发明制备的重组ASFVpB602L蛋白具有良好抗原性，建立的间接ELISA抗体检测方法具有灵敏、特异、高效的特点，适合于ASFV抗体的现场检测。CN115032387ACN115032387A权利要求书1/2页1.一种非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其是以ASFV非结构蛋白B602L抗原作为目的基因，以pColdⅠ质粒作为载体，成功构建重组质粒pColdⅠ‑B602L，通过原核表达系统获得了上清表达的重组pB602L蛋白，并对大量表达的目的蛋白进行纯化；以纯化的pB602L蛋白作为包被抗原，建立了猪ASFV间接ELISA抗体检测方法。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的重组质粒pColdⅠ‑B602L的构建过程包括如下步骤：(1)根据ASFV‑SY18毒株B602L基因设计特异性扩增引物进行扩增，在序列3'端末尾加入6个组氨酸标签，其中正向引物如SEQ.No.1所示，反向引物如SEQ.No.2所示；其中PCR扩增反应体系的组成为：2×LATaqPCRMasterMix，25μL，ForwardPrimer(10μM)2μL，ReversePrimer(10μM)2μL，质粒模板2μL，使用ddH2O补充至50μL；其中所述的PCR反应程序为：95℃保温5min，PCR扩增30个循环，其中每一循环的温度控制依次为95℃，30s；60℃，30s；72℃按照扩增速度为1min/kb扩增7min，退火至4℃终止扩增反应；(2)将原核表达载体pColdⅠ空载体使用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，将酶切反应体系加入灭菌EP管中，置37℃水浴锅中水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段，得到pColdⅠ酶切产物，其中酶切反应体系如下：表达载体pColdⅠ1μg，EcoRⅠ酶1μL，XbalⅠ酶1μL，10×CutSmartBuffer5μL，使用ddH2O补充至50μL；(3)将鉴定正确的胶回收产物目的基因B602L和表达载体pColdⅠ使用同源重组试剂盒进行连接，构建pColdⅠ原核表达载体，连接反应体系如下：pColdⅠ酶切产物30ng，ASFVB602L120ng，2×HieffCloneEnzymePremix10μL，使用ddH2O补充至20μL；将连接反应体系置于50℃水浴锅中，反应50min，反应结束后立即置于冰上3min或于‑20℃保存，得到同源重组连接产物；(4)将同源重组连接产物转化至DH5α感受态细胞，振荡培养后将菌液涂布于氨苄抗性的LB平皿，置于37℃恒温细菌培养箱中，倒置过夜培养，挑取单克隆菌落，置于LB培养基中进行菌落PCR鉴定，其反应体系如下：2×LATaqPCRMasterMix10μL，菌液5μL，ForwardPrimer(10μM)0.5μL，ReversePrimer(10μM)0.5μL，ddH2O4μL；反应程序如下：(5)PCR反应结束后使用1％的琼脂糖核酸胶进行电泳，将目的条带的单克隆菌落，接种于含有氨苄抗性的LB培养基中，振荡培养后按照小提质粒DNA试剂盒步骤提取质粒，测序并确定质粒浓度后保存‑20℃，命名为pCold‑B602L质粒。3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在