一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115531527A(43)申请公布日2022.12.30(21)申请号202211326779.7C12N1/02(2006.01)(22)申请日2022.10.25C12R1/01(2006.01)(71)申请人浙江省农业科学院地址310021浙江省杭州市江干区石桥路145号(72)发明人黄叶娥刘燕鲍国连崔雪梅季权安(74)专利代理机构北京华清迪源知识产权代理有限公司11577专利代理师丁彦峰(51)Int.Cl.A61K39/02(2006.01)A61K39/39(2006.01)A61P31/04(2006.01)C12N1/20(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图5页(54)发明名称一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用，具体涉及免疫生物学领域。包括步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品。本发明采用超滤法制备的了波氏杆菌的外膜囊泡，并将其通过挤压器，反复挤压，与纳米地黄多糖相结合，构建针对波氏杆菌的纳米亚单位疫苗，旨在增强单独外膜囊泡的稳定性，改善其免疫效果。CN115531527ACN115531527A权利要求书1/1页1.一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，包括：步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品。2.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩法为先将单个菌落进行扩大培养；再将扩大培养的滤液进行离心、过滤后超滤、浓缩；浓缩液离心后重悬，得波氏杆菌外膜囊泡。3.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述扩大培养时，培养液中添加头孢氨苄64μg/mL。4.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述过滤后超滤的条件为过滤是经过0.45μm的滤器；超滤装置的截留分子量为100kDa。5.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述重悬为TE缓冲液重悬或PBS缓冲液重悬。6.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述薄膜分散法结合超声法包括：大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE‑PEG2000溶于甲醇和氯仿混合液中，搅拌溶解，减压旋转蒸发除去有机溶剂；瓶壁形成一层均匀的薄膜后，导入熟地多糖的水溶液，水化后继续旋蒸；瓶壁薄膜完全洗脱，加入ddH2O继续旋转蒸发；蒸发结束后，利用探头式超声细胞粉碎机进行超声粒径均一化处理，再将粒径均一化处理的溶液挤压过微孔滤膜，得纳米地黄多糖免疫佐剂。7.根据权利要求6所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述探头式超声细胞粉碎机得强度40％，10s开，10s停，工作时间2min。8.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述聚碳酸酯膜得粒径为200nm。9.一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品，其特征在于，是由权利要求1‑8任一方法制备而成。10.一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品在制备纳米亚单位疫苗中的应用。2CN115531527A说明书1/6页一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及免疫生物学领域，具体涉及一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用。背景技术[0002]细菌外膜囊泡(outermembranevesicles，OMVs)是由革兰阴性细菌以出芽的方式分离出来的直径为20～300nm的球形双层纳米结构。细菌产生的膜囊泡保留了源细菌的理化特性，但不能再生和复制。[0003]由于OMVs中的膜相关蛋白和毒力因子可诱导细胞产生免疫反应，表明OMVs可以作为免疫原性物质刺激组胞阻止病原体入侵。因此，具有高免疫原性和非复制性的OMVs是疫苗的优良候选者之一。[0004]目前波氏杆菌疫苗都是灭活苗，虽能使机体产生抗体，但持续时间短，保护率低，不能有效抵御再次感染。发明内容[0005]为此，本发明提供一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品及其制备方法