鲍曼不动杆菌外膜囊泡及其制备方法以及它们的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111471616A(43)申请公布日2020.07.31(21)申请号202010265241.4A61P31/04(2006.01)(22)申请日2020.04.07C12R1/01(2006.01)(71)申请人中国人民解放军陆军军医大学地址400038重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号(72)发明人李海波李笋邹全明季露陈大群曾浩张卫军鲁东水罗萍(74)专利代理机构重庆志合专利事务所(普通合伙)50210代理人胡荣珲(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N1/06(2006.01)A61K35/74(2015.01)权利要求书2页说明书14页附图12页(54)发明名称鲍曼不动杆菌外膜囊泡及其制备方法以及它们的应用(57)摘要本发明涉及外膜囊泡(OMV)领域，公开了鲍曼不动杆菌外膜囊泡及其制备方法以及它们的应用。该方法包括：将鲍曼不动杆菌的发酵液进行第一固液分离，得到菌体沉淀，然后向所述菌体沉淀中加入不含去污剂的缓冲液并对所述菌体的细胞壁进行破坏。本发明提供的从鲍曼不动杆菌中提取细菌外膜囊泡的方法不使用任何去污剂，该方法提取外膜囊泡收率高，且对保护小鼠免于鲍曼不动杆菌感染具有较好的效果。CN111471616ACN111471616A权利要求书1/2页1.一种从鲍曼不动杆菌中提取外膜囊泡的方法，其特征在于，该方法包括：将鲍曼不动杆菌的发酵液进行第一固液分离，得到菌体沉淀，然后向所述菌体沉淀中加入不含去污剂的缓冲液并对所述菌体的细胞壁进行破坏。2.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述菌体的细胞壁进行破坏的方法选自酶解、超声、剪切、研磨、压碎、微流化、空强化和渗透休克中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述菌体的细胞壁进行破坏的方法为剪切，所述不含去污剂的缓冲液含有Tris-HCl、NaCl和EDTA；优选的，在所述缓冲液中，Tris-HCl的浓度为0.01-0.2M、NaCl的浓度为0.05-0.3M、EDTA的浓度为0.005-0.05M，所述缓冲液的pH值为6-9。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述剪切的方法包括：向所述菌体沉淀中加入所述缓冲液，得到菌悬液，然后将所述菌悬液进行温育，温育后对所述菌体进行剪切分散，以将细胞壁进行破坏，得到破壁产物；优选的，相对于1g的所述菌体沉淀，所述缓冲液的加入量为1-10ml；优选的，所述温育的条件包括：温度50-60℃，时间20-40min；优选的，所述剪切分散的条件包括：温度20-40℃，剪切速度为8000-25000rpm，时间为1-10min。5.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括：将所述破壁产物进行第二固液分离，得到鲍曼不动杆菌外膜囊泡的粗品；优选的，所述第二固液分离包括依次进行的第一离心、第二离心、第三离心和第四离心；其中，所述第一离心包括：将所述破壁产物在10000-20000g、2-6℃的条件下进行离心处理，得到第一上清液；所述第二离心包括：将所述第一上清液在20000-30000g、2-6℃的条件下进行离心处理，得到第二上清液；所述第三离心包括：将所述第二上清液在30000-50000g、2-6℃的条件下进行离心处理，得到第三上清液；所述第四离心包括：将所述第三上清液在50000-120000g、2-6℃的条件下进行离心处理，收集沉淀，得到鲍曼不动杆菌外膜囊泡的粗品；优选的，该方法还包括：将所述鲍曼不动杆菌外膜囊泡的粗品进行洗涤，获得鲍曼不动杆菌外膜囊泡的纯品；优选的，所述洗涤的方法包括：将所述鲍曼不动杆菌外膜囊泡的粗品重悬于PBS缓冲液中，并于20000-50000g、2-6℃的条件下进行离心处理，收集沉淀，得到鲍曼不动杆菌外膜囊泡的纯品。6.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述菌体的细胞壁进行破坏的方法包括酶解法和超声法，所述不含去污剂的缓冲液含有蔗糖、Tris-HCl、EDTA和溶菌酶；优选的，在所述缓冲液中，蔗糖的浓度为0.05-1M、Tris-HCl的浓度为0.01-0.2M、EDTA的浓度为1-5mM，溶菌酶的浓度为0.05-20mg/ml，所述缓冲液的pH值为6-9；优选的，相对于1g的所述菌体沉淀，所述缓冲液的加入量为15-100ml。7.根据权利要求6所述的方法，其中，利用酶解法和超声法对所述菌体的细胞壁进行破2CN111471616A权利要求书2/2页坏的方法包括：向所述菌体沉淀中加入含有蔗糖和EDTA的第一蔗糖溶液，得到重悬菌液，然后向所述重悬菌液中加入溶菌酶和EDTA，并将得到的混合物料进行超声破壁；优选的，相对于1g的所述菌体沉淀，所述第一蔗糖溶液的加入量为15-100ml，所述第一蔗糖溶液含有0.05-1M的