一种PRRSV基因组全长cDNA质粒、PRRS病毒及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115612696A(43)申请公布日2023.01.17(21)申请号202210770868.4A61K39/12(2006.01)(22)申请日2022.06.30A61P31/20(2006.01)C12R1/93(2006.01)(71)申请人肇庆大华农生物药品有限公司地址526238广东省肇庆市高新区创业路5号申请人华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司(72)发明人陈瑞爱温良海张古月黄梅(74)专利代理机构广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙)44288专利代理师陈奕(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/64(2006.01)C12N7/00(2006.01)权利要求书1页说明书22页附图4页(54)发明名称一种PRRSV基因组全长cDNA质粒、PRRS病毒及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种PRRSV基因组全长cDNA全长质粒、PRRS病毒及其构建方法和应用，属于生物技术领域，以PBR322作为基础载体，包括PRRSV基因组全长cDNA序列和CMV启动子序列，bGHpoly(A)signal序列，CMV启动子序列设置在PRRSV基因组全长cDNA序列的上游，bGHpoly(A)signal序列设置在PRRSV基因组全长cDNA序列的下游，PRRSV基因组全长cDNA全长质粒为pBR322‑CMV‑rJXA1R，其序列如如SEQIDNo.1所示。该PRRSV基因组全长cDNA全长质粒保真度高，构建便捷效率高。CN115612696ACN115612696A权利要求书1/1页1.一种基于反向遗传学构建的PRRSV基因组全长cDNA全长质粒，以PBR322质粒作为基础载体，其特征在于，包括PRRSV基因组全长cDNA序列和CMV启动子序列，bGHpoly(A)signal序列，所述CMV启动子序列设置在所述PRRSV基因组全长cDNA序列的上游，启动所述PRRSV基因组全长cDNA序列的转录，所述bGHpoly(A)signal序列设置在所述PRRSV基因组全长cDNA序列的下游，终止所述PRRSV基因组全长cDNA序列的转录，所述PRRSV基因组全长cDNA全长质粒为pBR322‑CMV‑rJXA1R，其序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述的一种基于反向遗传学构建的PRRSV基因组全长cDNA全长质粒的构建方法，其特征在于，以所述pBR322质粒为模板，如SEQIDNo.2所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.3所示的序列为反向引物，PCR扩增得到pBR322线性片段；以pEGFP‑C1质粒作为模板，如SEQIDNo.4所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.5所示的序列为反向引物，PCR扩增得到CMV片段；以pcDNA3.1(+)质粒作为模板，如SEQIDNo.6所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.7所示的序列为反向引物，PCR扩增得到bGHpoly(A)signal序列，将所述pBR322线性片段、所述CMV片段、所述bGHpoly(A)signal序列进行同源重组，得到pBR322‑CMV质粒，所述pBR322‑CMV质粒的序列如SEQIDNo.8所示；以所述pBR322‑CMV质粒为模板，如SEQIDNo.9所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.10所示的序列为反向引物，PCR扩增得到pBR322‑CMV线性片段；以所述PRRSV基因组全长cDNA序列为模板，如SEQIDNo.11所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.12所示的序列为反向引物，PCR扩增得到PRRSV‑F1扩增片段；如SEQIDNo.13所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.14所示的序列为反向引物，PCR扩增得到PRRSV‑F2扩增片段；如SEQIDNo.15所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.16所示的序列为反向引物，PCR扩增得到PRRSV‑F3扩增片段；如SEQIDNo.17所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.18所示的序列为反向引物，PCR扩增得到PRRSV‑F4扩增片段；如SEQIDNo.19所示的序列为正向引物，如SEQIDNo.20所示的序列为反向引物，PCR扩增得到PRRSV‑F5扩增片段；将所述pBR322‑CMV线性片段、所述PRRSV‑F1扩增片段、所述PRRSV‑F2扩增片段、所述PRRSV‑F3扩增片段、所述PRRSV‑F4扩增片段、所述PRRSV‑F5扩增片段进行同源重组，得到所述PRRSV基因组全长cDNA全长质粒，所述PRRSV基因组全长cDNA全长质粒如SEQIDNo.21所示。3.根据权利要求2所述的一种表基于反向遗传学构建的PRRSV基因组全长cDNA全长质粒