一种圆圈病毒3型双拷贝全长基因感染性克隆质粒及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113684190A(43)申请公布日2021.11.23(21)申请号202110935119.8C12N15/85(2006.01)(22)申请日2021.08.16C12N15/34(2006.01)C12R1/92(2006.01)(66)本国优先权数据202110470375.42021.04.29CN(83)生物保藏信息CCTCCNO:V2020612020.10.01(71)申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市泰山区岱宗大街61号(72)发明人成子强张贤文(74)专利代理机构山东祺智知识产权代理有限公司37361代理人赵斌(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书11页C12N7/00(2006.01)序列表6页附图5页(54)发明名称一种圆圈病毒3型双拷贝全长基因感染性克隆质粒及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及病毒学和生物技术领域，涉及一种利用反向遗传学技术的圆圈病毒3型(GyV3)双拷贝全长基因感染性克隆及其构建方法和应用，具体利用GyV3的环状基因组结构特点和自带的酶切位点，使用高保真酶扩增到两段不同起止点的病毒全基因组，通过两次连接转化连接于真核表达pcDNA3.1(+)构建GyV3双拷贝全长感染性克隆pcDNA3.1‑2GyV3，并且实现SPF鸡体内的病毒拯救和致病性研究；最终提供了一种简单、快捷的圆圈病毒反向遗传学操作系统，为GyV3致病性及基因结构与功能研究等方面提供平台，也为研究针对GyV3的基因工程疫苗奠定了基础。CN113684190ACN113684190A权利要求书1/1页1.一株鸡新型圆圈病毒3型毒株，其特征在于：命名为GyV3SDAU‑2株，其生物保藏编号为CCTCCNO:V202061。2.一种圆圈病毒3型双拷贝全基因组感染性克隆质粒，其特征在于：该克隆质粒由真核表达载体pcDNA3.1(+)和圆圈病毒3型双拷贝全基因组组成，命名为pcDNA3.1‑2GyV3，其中双拷贝全基因组感染性克隆的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.权利要求1所述圆圈病毒3型双拷贝全基因组感染性克隆质粒的应用，其特征在于：该质粒用于圆圈病毒3型体内的病毒拯救及致病性研究。2CN113684190A说明书1/11页一种圆圈病毒3型双拷贝全长基因感染性克隆质粒及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及病毒学和生物技术领域,涉及一种利用反向遗传学技术的圆圈病毒3型双拷贝全长基因感染性克隆及其构建方法和应用。背景技术[0002]圆圈病毒3型(Gyrovirus3,GyV3)是继鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectiousanaemiavirus,CAV或CIAV)之后的第三个圆圈病毒属成员，分类于编码复制相关蛋白的单链环状DNA病毒门(Circularreplication‑associatedprotein‑encodingsingle‑strandedDNAviruses，CRESSDNAviruses)的指环病毒科(Anelloviridae)。GyV3自2012年在智利儿童未知病因急性肠胃炎腹泻粪便中通过宏病毒组学鉴定命名以来，先后在人类不同年龄腹泻粪便、雪貂腹泻粪便和市场鸡肉中被发现。由于其发现样品的广泛性和复杂性，GyV3与疾病的相关性和宿主范围引起医学和兽医学界的共同关注。2018年，发明人在临床患有未知病因腺胃炎的白羽肉鸡腺胃中鉴定到GyV3，并在回顾性流行病学调查中发现其在2013‑2017年收集的肉鸡腺胃炎病料中有12.5％(42/336)的感染率，且在之后的致病性实验中明确其可感染鸡和小鼠，同时实现两群体间的水平传播。由此可见GyV3与肉鸡腺胃炎有很大的相关性，而且其跨物种传播现象提示潜在的公共卫生意义，其深入研究亟待进行，但由于缺乏成熟的分离纯化技术和有效的体外培养体系，GyV3确切的致病性和研究受到严重阻碍。[0003]GyV3基因结构为单链环状的负义DNA，大小为2.3Kb，包含3个同向重叠的开放阅读框(ORF)和一个非编码区(UTR)。3个ORFs分别编码病毒的3个蛋白，即衣壳蛋白VP1，支架蛋白VP2和凋亡蛋白VP3，这些蛋白质通过交替使用起始密码子从单个多顺反子mRNA翻译而来，但是密码子交替使用的真实机制还没有被阐明。圆圈病毒的复制方式尚未得到所有科学家的公认，至今缺乏明确结论。目前主流观点认为其DNA采取滚环复制(RCR)的方式进行复制，但是已经明确的是病毒缺乏复制自身DNA的机制,依赖于分裂宿主细胞进行DNA复制，在此过程中经历一个双链DNA复制形式(dsRF)，这为GyV3全基因组的普通PCR扩增和感染性克隆构建奠定分子基础。[0004]感染性克隆作为病毒反向遗传