一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115678829A(43)申请公布日2023.02.03(21)申请号202211312310.8(22)申请日2022.10.25(71)申请人西北农林科技大学地址712100陕西省咸阳市杨凌示范区西农路22号(72)发明人安小鹏宋宇轩张磊江悦朱俊儒李广(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师黄明光(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书1页说明书7页附图4页(54)发明名称一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法(57)摘要本发明提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，属于生物技术领域。本发明利用凝乳酶去除山羊乳中的酪蛋白，采取超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡粗产物，再加入蔗糖垫进行纯化，获得了高纯度、高质量的山羊乳细胞外囊泡。本发明还提供了利用上述方法提取的山羊乳细胞外囊泡，促进了对山羊奶细胞外囊泡具体功能的研究和应用。CN115678829ACN115678829A权利要求书1/1页1.一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：取乳样上清A，加入凝乳酶后，按照2000‑3000g的转速离心收集上清B；将所述上清B于4℃，按照80000‑120000g的转速离心30‑40min，收集上清C，使用微滤膜过滤，收集滤液D；将所述滤液D于4℃，按照80000‑120000g的转速离心60‑80min，收集沉淀F即为细胞外囊泡粗产物；将所述细胞外囊泡粗产物重悬，获得的细胞外囊泡重悬样本加到蔗糖垫上，于4℃，按照80000‑120000g的转速离心60‑80min；取出所述蔗糖垫，稀释后，于4℃，按照80000‑120000g的转速离心60‑80min，去除上清，所得沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝乳酶的使用浓度为0.03‑0.05mg/mL，添加量为1.75mg/50mL乳液上清。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括，将所述滤液D于4℃，按照80000‑120000g的转速离心60‑80min，收集沉淀E；将所述沉淀E重悬后，于4℃，按照80000‑120000g的转速离心60‑80min，收集沉淀F为细胞外囊泡粗产物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖垫浓度为30％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡重悬样本与蔗糖垫的体积比为2:1‑5:1。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山羊乳细胞外囊泡直接置于‑80℃保存，或稀释后于‑80℃保存。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳样上清A的获得方法包括如下步骤：取乳样，于4℃，按照3000‑5000g的转速离心10min，收集上清即为乳样上清A。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳样为山羊乳，所述山羊乳为新鲜乳液，或冻存于‑80℃，使用时于37℃下解冻后的乳液。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用微滤膜过滤为使用0.45μm滤膜过滤。10.一种山羊乳细胞外囊泡，其特征在于，采用权利要求1‑9任意一项所述的利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法获得。2CN115678829A说明书1/7页一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法。背景技术[0002]细胞外囊泡(ExtracellularVesicles，EV)是由细胞分泌的一种没有复制能力的纳米颗粒，它们存在于各种生物液体中，并已经被证实在细胞间通信中发挥关键作用。[0003]细胞外囊泡在不同细胞类型之间起着交换运输蛋白质、脂质、miRNA或DNA的作用，目前已经被证明在肿瘤转移、组织再生等过程中发挥重要作用，并已被提出作为不同疾病的预后标志物。例如近年来研究较为广泛的间充质干细胞(MSC)来源的EV具有与MSC相似的生物学效应，如减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等，而且易提取、改造，与干细胞移植相比致肿瘤风险低，在损伤修复的生物学治疗中具有广阔应用前景。目前各种细胞培养液上清等来源的细胞外囊泡较难获得且提取后浓度较低，难以大批量生产使用，由于EV的体积非常小，对其分离、观察和鉴定具有一定的挑战性，寻找高效的EV分离和鉴定方法是研究的前提。[0004]在可能的来源中，乳汁无毒无害且易于获得，可以从中获得高产量、无害和成本效益的细胞外囊泡，因此探究从乳中提取高质量的细胞外囊泡方法具有重大意义。目前针对人乳、牛乳、猪乳、骆驼乳中细胞外囊泡的研究较为广泛，其无毒性和非免疫原性在健康模型中已被证实，