提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114807020A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210261966.5(22)申请日2022.03.17(71)申请人上海交通大学医学院附属第九人民医院地址200111上海市黄浦区制造局路639号(72)发明人刘凯潘楚乔许鹏(74)专利代理机构上海申浩律师事务所31280专利代理师赵建敏(51)Int.Cl.C12N5/077(2010.01)A61K35/35(2015.01)A61P17/02(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图4页(54)发明名称提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法及应用(57)摘要本发明公开了提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法及应用，本发明脂肪全组织细胞外囊泡的提取过程中，仅需要脂肪组织漂洗、离心保留中间脂肪组织，脂肪组织冰上匀浆、离心的下清液，下清液中脂肪全组织细胞外囊泡提取三个步骤。全程操作简单，纯机械提取操作，无需进行细胞培养或采用药物进行处理，不仅耗时短，而且提取得到的细胞外囊泡几乎不受外界毒性因素影响，安全性高，达到临床级。通过体外体内实验，发现脂肪组织细胞外囊泡具有良好的促进血管生成和皮肤创面愈合的能力。CN114807020ACN114807020A权利要求书1/1页1.一种提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括如下步骤：A、脂肪组织提取将收集的脂肪组织经过无菌生理盐水漂洗、静置后离心，离心结束后，去除底端多余水分，保留中间的脂肪组织；B、脂肪组织处理向去除水分的脂肪组织内加入等体积无菌生理盐水，在匀浆机上以20000‑25000rpm条件冰上匀浆一定时间，将脂肪处理为匀质状，离心后弃去上层残余组织，保留下层清液；C、提取细胞外囊泡将步骤B中保留的下层清液依次经微滤、超滤、低温离心浓缩后移入无菌冻存管，并冷冻保存。2.根据权利要求1所述的提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法，其特征在于：其中，步骤A中，所述脂肪组织来源于抽脂患者的自体脂肪组织，抽脂设备选自注射器或者机械负压机，不加用激光、超声及微波等辅助手段。3.根据权利要求1所述的提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法，其特征在于：其中，步骤A中，离心时，将漂洗后的脂肪组织置于离心机内，以500‑2000rpm，37℃，5min离心。4.根据权利要求1所述的提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法，其特征在于：其中，步骤B中，脂肪组织的冰上匀浆时间为1分钟，将脂肪处理为匀质状，而后1000‑4000g，4℃，5min离心，弃去上层残余组织，保留下层清液。5.根据权利要求1所述的提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法，其特征在于：其中，步骤C中，上清液用0.22μm滤器过滤后加入100KD膜的超滤离心管，3000g、4℃离心浓缩至内管体积500μL，移入无菌冻存管，转移至‑80℃冰箱冻存。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法提取得到的脂肪全组织细胞外囊泡。7.权利要求6所述的脂肪全组织细胞外囊泡在制备促皮肤创面愈合药物中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：其中，所述促皮肤创面愈合药物为提高皮肤成纤维细胞增殖和迁移能力的药物、促进脐静脉内皮细胞系成血管能力和细胞活力的药物、或促进表皮细胞系细胞活力和迁移能力的药物。9.一种促皮肤创面愈合药物，其特征在于，含有权利要求6所述的脂肪全组织细胞外囊泡，该脂肪全组织细胞外囊泡的添加质量为10％‑50％。2CN114807020A说明书1/5页提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法及应用技术领域[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种提取临床级脂肪全组织细胞外囊泡的方法以及该外囊泡的具体应用。背景技术[0002]细胞外囊泡(Excellularvesicles,EVs)是细胞分泌出来的混合颗粒，包括微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes)，这两种颗粒分别通过出芽和形成多泡体后释放到胞外，携带着其包裹的内容物作用于受体细胞。外囊泡作为细胞间信号传导介质，避免了许多细胞治疗所涉及的安全问题：如干细胞治疗会有免疫原性强、肿瘤形成的风险，可能会堵塞细小血窦。而细胞外囊泡的免疫原性很低，可进行同种异体应用。[0003]此外，EVs特殊的双分子层结构保护其内容物相对稳定且免受破坏，通过转运多种生物活性成分(蛋白质、脂质、核酸等)使其实现对受体细胞的多途径调节，在组织修复与再生、揭示发病机制、参与免疫调节等方面都发挥了重要的作用，使无细胞治疗成为了可能。[0004]现有的EVs提取方法主要分为干细胞上清液提取法和组织提取法。其中，干细胞培养液提取法需要经过长时间的细胞培养，且产物应用于临床需经过高成本动物毒理实验的检测，难以实现临床转化。已有的组