一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113621645A(43)申请公布日2021.11.09(21)申请号202110883992.7(22)申请日2021.08.03(71)申请人中山大学附属第八医院（深圳福田）地址518033广东省深圳市福田区深南中路3025号(72)发明人伍贵富范均钰范文冬潘嘉捷(74)专利代理机构深圳市创富知识产权代理有限公司44367代理人叶灿才(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/67(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表7页附图6页(54)发明名称一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法(57)摘要本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，本发明提供一种含肉豆蔻酰化肽段的装载系统编码质粒，将该载系统编码质粒单独在细胞中表达，能使细胞产生的EV数量明显增高；将该载系统编码质粒与目标蛋白货物在细胞中同时过表达，能使目标货物高效的装载至细胞产生的EV中。本发明的EV包装目标蛋白的方法操作简单，不需要将包装系统与目标货物以直接或间接的形式进行偶联，避免了对目标货物进行序列改造，同时避免了物理装载法可能导致的EV及货物完整性破坏，使货物与野生型蛋白质的序列高度一致，而且也不会影响货物在细胞内的定位和功能。CN113621645ACN113621645A权利要求书1/1页1.一种装载系统编码质粒，其特征在于，所述装载系统编码质粒为含肉豆蔻酰化肽段的装载系统编码质粒，所述肉豆蔻酰化肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述装载系统编码质粒可用于提高细胞外囊泡的产量，并促进细胞外囊泡包装目标蛋白。2.根据权利要求1所述的一种装载系统编码质粒，其特征在于，所述装载系统编码质粒还包括GFP和HA，所述装载系统编码质粒的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.一种提高细胞外囊泡产量的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的装载系统编码质粒转染到细胞中进行表达，即可提高细胞产生外囊泡的数量。4.一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的装载系统编码质粒和目标蛋白编码质粒共同转染到细胞中进行过表达，即可提高细胞外囊泡包装目标蛋白的数量。5.根据权利要求3所述的一种提高细胞外囊泡产量的方法或根据权利要求4所述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，其特征在于，所述细胞包括HEK293细胞。6.根据权利要求3所述的一种提高细胞外囊泡产量的方法或根据权利要求4所述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，其特征在于，当所述细胞的密度培养至60‑80％时再进行转染。7.根据权利要求3所述的一种提高细胞外囊泡产量的方法或根据权利要求4所述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，其特征在于，所述转染采用脂质体法。8.根据权利要求4所述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，其特征在于，所述目标蛋白编码质粒包括mCherry‑Nluc‑3×FLAG、Cre‑3×FLAG、lentiCRISPRv2，所述mCherry‑Nluc‑3×FLAG的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，所述Cre‑3×FLAG的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示。2CN113621645A说明书1/8页一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法技术领域[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法。背景技术[0002]细胞可以向外界释放膜结构的囊泡，称为细胞外囊泡(Extracellularvesicles,EV)。EV具有多种作用：(1)由于EV携带有来源于细胞的核酸、蛋白质、脂质、糖类等物质信息，进入循环中的EV可作为细胞分化、组织器官发育、疾病发生发展不同阶段的标志物；(2)EV是不同类型、不同状态的细胞之间进行信号转导、物质传递的一种形式，阻断或抑制某些EV介导的病理性细胞间的通讯可以延缓疾病的发生、发展；(3)EV可以作为生物纳米材料广泛应用于疾病治疗和基因工程等领域。[0003]EV可以作为一种治疗载体，通过人为装载的货物而发挥作用。与脂质体或聚合物纳米材料载体相比，EV纳米治疗平台具有生物相容性好、毒性低、安全性高、可改造性强、循环半衰期长等优点，但存在产量低，装载效率低等缺陷。[0004]当前，采用EV包装目标蛋白货物的方法主要有以下几种：(1)先提取细胞自然产生的EV，再通过室温孵育、电穿孔、超声、冻融、挤压、皂苷辅助装载等物理方法将目标货物直接装载到EV内部，再将装载好的EV从溶液中纯化出来。该方