高效生产细胞外囊泡的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114369565A(43)申请公布日2022.04.19(21)申请号202111674781.9(22)申请日2021.12.31(71)申请人清华大学深圳国际研究生院地址518000广东省深圳市南山区西丽大学城清华校区(72)发明人马少华谭嘉懿曹远雄(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人刘燚(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)C12N5/0775(2010.01)C12N15/87(2006.01)A61K47/46(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称高效生产细胞外囊泡的方法(57)摘要本发明公开了高效生产细胞外囊泡的方法。本申请所提供生产细胞外囊泡的方法包括以下步骤：取细胞与生物相容性材料混合，得到混合液；将混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性三维体；将生物相容性三维体置于细胞培养基中培养，收集上清得到细胞外囊泡。通过上述方法无损负载细胞形成三维体，构建良好的细胞通信微环境，有效提高细胞分泌细胞外囊泡的效率，达到细胞最大效用化利用。该方法普适性高、工艺简单、耗时短、均一性高，能够作为大规模生产细胞外囊泡的技术平台。能够保留细胞的原有形态、结构及功能，不会降低细胞活性、导致细胞凋亡或改变其表型，因此不会削弱细胞外囊泡的诊断、治疗等功能。CN114369565ACN114369565A权利要求书1/1页1.生产细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取细胞与生物相容性材料混合，得到混合液；S2：将所述混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性三维体，所述生物惰性液与所述生物相容性材料互不相溶；S3：将所述生物相容性三维体置于细胞培养基中培养，收集上清得到细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物相容性三维体的大小为100～2000微米或所述生物相容性三维体的体积为0.0005～5微升。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物相容性三维体中的细胞密度为每三维体100～100000个细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述生物相容性三维体经熟化作用固化形成。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的直径在50～300nm。6.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述生物相容性材料的杨氏模量小于100kPa。7.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述生物惰性液为氟油。8.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自干细胞、肿瘤细胞、纤维细胞、巨噬细胞、NK细胞、DC细胞、T细胞中的至少一种。9.细胞外囊泡组合物，采用权利要求1至8任一项所述的方法收集得到。10.权利要求9所述的细胞外囊泡组合物在制备递送载体、药物、检测产品中的应用。2CN114369565A说明书1/6页高效生产细胞外囊泡的方法技术领域[0001]本申请涉及细胞技术领域，尤其是涉及高效生产细胞外囊泡的方法。背景技术[0002]随着国内外对细胞外囊泡(含外泌体)的研究逐渐增多，目前人们已提出多种提高细胞外囊泡产量的方法，包括利用生物反应器系统提供较大的表面积，方便细胞进行扩增，从而提高细胞外囊泡产量，但这种方式本身并不能够提高细胞分泌囊泡的效率，而且在规模化生产条件下，培养条件的同质性难以监测；还包括改变细胞培养条件的方法，例如通过施加机械刺激、改变细胞环境酸碱度、诱导细胞缺氧、升高细胞间离子霉素和钙离子含量等提高细胞外囊泡产量，但这种方式对于细胞完整性、细胞活性等有较为明显的影响，囊泡类型的同质性难以保证，并且有可能削弱细胞外囊泡的治疗潜力。[0003]除此之外，研究人员尝试对细胞培养形式进行改进，通过悬滴培养细胞或悬浮培养细胞诱导细胞肌动蛋白解聚、利用微载体形成细胞微球为细胞生长提供高表面积与体积比等方法提高细胞外囊泡产量。然而，悬浮或悬滴培养的方式耗时较长、批次间异质性大。利用微载体形成细胞微球的方法需要复杂、繁琐的微载体制备工艺，而且细胞微球的形成需要复杂的装置与长时间的搅拌混合，需要精准控制细胞接种于微载体上的浓度与搅拌条件，防止细胞聚集体的早期形成损害细胞生长和特性。此外，不同的微载体表面底物会引起细胞表型的变化，如材料刚度、纳米形貌和局部曲率可能影响细胞增殖、蛋白表达水平降低等。因此，有必要提供一种更具普适性，能够保留细胞原有形态、结构及功能的高效生产细胞外囊泡的方法。发明内容[0004]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种更具普适性，能够保留细胞原有形态、结构及功能的高效生产细胞外囊泡的方法。[0005]本申请的第一方面，提供生产细