一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115717174A(43)申请公布日2023.02.28(21)申请号202211141568.6(22)申请日2022.09.20(71)申请人安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所地址230000安徽省合肥市农科南路40号(72)发明人杨雪潘锐谷春艳徐会永臧昊昱(74)专利代理机构合肥中谷知识产权代理事务所(普通合伙)34146专利代理师杜瑶(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用(57)摘要本发明公开了一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用，涉及植物病害检测技术领域，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5’‑TGCTATCCCTGTCCTCTCATTGGCTGTTTC‑3’，下游引物：5’‑CATGCTGTCGTTTAGAGATAGTGGAGTCCG‑3’包含如下引物。本发明首次将RPA技术应用于梨致病型链格孢菌的检测，建立了RPA快速检测体系，该检测体系与梨炭疽病、梨轮纹病、梨黑星病等常见病害的病原菌及其他致病型的链格孢菌均无交叉反应，特异性强。CN115717174ACN115717174A权利要求书1/1页1.一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5’‑TGCTATCCCTGTCCTCTCATTGGCTGTTTC‑3’，下游引物：5’‑CATGCTGTCGTTTAGAGATAGTGGAGTCCG‑3’。2.一种如权利要求1所述的特异性引物在梨致病型链格孢菌快速检测中的应用。3.一种梨致病型链格孢菌RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有植物基因组DNA提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阳性对照物。5.一种梨致病型链格孢菌RPA检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品基因组DNA；(2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，所用特异性引物为权利要求1中所述的特异性引物；(3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RPA反应的反应体系包含：权利要求1中所述的特异性引物、样品基因组DNA、RPA扩增反应试剂。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述RPA扩增反应试剂包括以下成分：BufferA、上游引物、下游引物、ddH2O和醋酸镁。8.根据权利要求6‑7任一所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：反应温度为42℃，反应时间为30分钟。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者核酸测序。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，检测到242bp的条带即表明待测样品是阳性样品。2CN115717174A说明书1/5页一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用技术领域[0001]本发明涉及植物病害检测技术领域，具体涉及一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用。背景技术[0002]梨是我国三大水果产业之一，而梨致病型链格孢菌导致的梨黑斑病是梨树上重要的病害之一，在中国主要梨区普遍发生。该病害主要危害叶片、果实及新梢，可引起早期落叶、落果，嫩梢枯死，直接影响梨的产量和品质。我国是梨果品出口大国，梨的安全生产及出口贸易极为重要，由于传统的植物病原真菌的检测方法耗时长，程序繁琐，易受到人为因素和环境条件的干扰，不适合快速检测的要求。因此，研究快速简便的检测方法对梨黑斑病的田间早期检测和口岸检验检疫具有现实意义。[0003]虽然链格孢菌广泛分布在植物、土壤和有机质中，但致病型的链格孢菌会对寄主植物产生选择性毒素。寄主选择性毒素是决定链格孢菌寄主范围和寄主高度专化性的致病因子，其中导致梨黑斑病的梨致病型链格孢菌会产生AK毒素。[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)技术是一种新型恒温扩增技术，在25‑43℃恒温条件下反应5‑30min就可以扩增出检测产物，不需要昂贵的变温实验仪器，且反应快速、灵敏度高、特异性强。目前该技术已成功应用于病毒、细菌、真菌等多种病原物的检测中，但对于梨致病型链格孢菌的RPA检测尚未见报道。发明内容[0005]本发明的目的在于克