用于植物病原尖孢镰刀菌的RPA-LFD引物及检测法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115976254A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211218367.1(22)申请日2022.10.05(71)申请人浙江农林大学地址311300浙江省杭州市临安区武肃街666号(72)发明人张传清胡硕丹余红张宇汪汉城(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212专利代理师金祺(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/77(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称用于植物病原尖孢镰刀菌的RPA-LFD引物及检测法(57)摘要本发明属于生物技术与植物病害流行学领域。本发明公开了一种基于RPA‑LFD法检测植物病原尖孢镰刀菌的组合物，包括检测病菌的引物对和探针。本发明还同时公开了包含上述引物对和探针的快速检测植物尖孢镰刀菌的RPA‑LFD试剂盒，以及公开了利用上述试剂盒快速检测草莓等植物病菌的方法。本发明建立了草莓茎基腐病菌的快速、特异性、灵敏度高的定量监测技术体系，该方法的建立对茎基腐病等FOSC引起的病害的早期诊断、预警和预测预报和防控具有十分重要的意义。CN115976254ACN115976254A权利要求书1/1页1.一种基于RPA‑LFD法检测植物病原尖孢镰刀菌的组合物，其特征在于，所述组合物包括检测病菌的引物对和探针；所述引物对：上游引物：5’‑TCAACTGGCATCGTCAACATCACCGAAGTAA‑3’下游引物：5’‑Biotin‑CCAGGCATGACGAAGTTGATAGGTTGAAAGC‑3’所述探针序列：5’‑6‑FAM‑GAGGATGTTGATTGCTATTCTGATGGGTGGG/idSp/CAGCACAACACTGCTGCTA‑C3Spacer‑3’。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述下游引物5’端使用Biotin标记，所述探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为C3Spacer。3.一种用于快速检测植物尖孢镰刀菌的RPA‑LFD试剂盒，其特征在于，所述RPA‑LFD试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。4.根据权利要求3所述的RPA‑LFD试剂盒，其特征在于：所述RPA‑LFD试剂盒还包括反应Abuffer、Bbuffer、HybriDetect胶体金试纸条、ddH2O。5.利用如权利要求3或4所述的试剂盒快速检测草莓等植物病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤；(1)提取样本核酸；(2)采用组合物对步骤(1)提取的样本核酸进行RPA扩增反应，50μL体系中含有Abuffer29.4μL、10μM的正向引物2μL，10μM的反向引物2μL，10μM的探针0.6μL，Bbuffer2.5μL，DNA模板2μL，双蒸水补足至50μL；RPA‑LFD扩增反应程序为：39℃，8min；(3)取10μL步骤(2)得到的反应产物加入至190μLddH2O中，混匀后取50μL稀释后的扩增产物滴入HybriDetect胶体金试纸条加样孔，5min内记录控制线和检测线，判定试验结果。6.根据权利要求5所述的快速检测草莓等植物病菌的方法，其特征在于，所述判定试验结果的方法如下：若控制线可见，检测线不可见，此为阴性结果，即，判定DNA模板对应的待测物中不含有植物病原尖孢镰刀菌；若检测线和控制线均可见，此为阳性结果；即，判定DNA模板对应的待测物中含有植物病原尖孢镰刀菌；若检测线和控制线均不可见，需要重新进行检测。2CN115976254A说明书1/9页用于植物病原尖孢镰刀菌的RPA‑LFD引物及检测法技术领域[0001]本发明属于生物技术与植物病害流行学领域，涉及重组酶聚合酶扩增(recombinaseploymeraseamplication,RPA)技术结合侧向流动试纸条(lateralflowdipstick,LFD)检测用于监测植株、土壤等场所植物病原尖孢镰刀菌的重组酶聚合酶扩增引物组及其使用方法，属于植物病害流行学、动态监测及预警的技术领域。背景技术[0002]镰刀菌属(Fusariumsp.)是土壤中重要的真菌，其中尖孢镰刀菌复合种(FusariumoxysporumSpeciesComplex,FOSC)寄主广泛且致病力较强，被列为世界十大植物病原真菌之一，严重威胁茄子、辣椒多种蔬菜及其它经济等植物的生产。[0003]发明人所在课题组在发明前期的研究中发现由FOSC造成的草莓茎基腐病是目前对草莓生产危害最严重的病害。被感染的植株茎基部维管束变褐色，植株因无法吸水导致地上部分萎蔫，造成相当大的经济损失，病原菌会从母株通过匍匐茎传递到子