嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115976245A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202210794632.4(22)申请日2022.07.05(71)申请人新疆农业大学地址830052新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区农大东路311号(72)发明人马荣陈帅康刘楚丽侯刘娟王彩霞董安昊(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002专利代理师黄爽(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法(57)摘要本发明提供嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法。本发明基于嗜果刀孢菌和其他真菌的tef1基因的序列差异，筛选出一对可快速检测嗜果刀孢菌病菌的特异性引物(SEQIDNO:1‑2)。在此基础上建立PCR检测体系，可以从发病植物组织中快速、准确地检测出嗜果刀孢菌。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对嗜果刀孢菌疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。CN115976245ACN115976245A权利要求书1/1页1.嗜果刀孢菌(Wilsonomycescarpophilus)特异性检测引物，其特征在于，包括：正向引物：5’‑GGGCATTTTTGGATGGTGGG‑3’反向引物：5’‑TGCCCAAAGGGATCATGGAC‑3’。2.含有权利要求1所述引物的检测试剂或试剂盒。3.嗜果刀孢菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物，还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。4.权利要求1所述引物或权利要求2或3所述检测试剂或试剂盒在嗜果刀孢菌检测中的应用。5.嗜果刀孢菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品总DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增；3)分析PCR扩增产物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以25μL计为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，模板DNA1μL，10μmol/L正、反向引物各0.5μL，ddH2O10.5μL。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃8分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃7分钟。8.根据权利要求5‑7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现一条113bp的特征性条带，则待测样品中含有嗜果刀孢菌。2CN115976245A说明书1/4页嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法。背景技术[0002]嗜果刀孢菌(Wilsonomycescarpophilus)是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物。嗜果刀孢菌通常以无性型作为基本的形态学识别特征，但其培养形态存在较大差异，嗜果刀孢菌在不同温度下菌落形态差异明显，并且同一菌株或不同菌株的重复间的菌落形态也不同，存在高度变异，易受环境等因素影响，难以从形态学特征识别，只能依靠多片段(ITS、LSU、tef1)的分子系统发育分析，对该病原菌进行鉴定，但传统的柯赫氏法则从病原物的分离、培养、回接和再分离耗时长且步骤繁杂，难以实现快速诊断。因此，亟需建立一种快速、有效的嗜果刀孢菌检测方法。发明内容[0003]本发明的目的是提供嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法。[0004]为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种嗜果刀孢菌(Wilsonomycescarpophilus)特异性检测引物，包括(SEQIDNO:1‑2)：[0005]正向引物：5’‑GGGCATTTTTGGATGGTGGG‑3’[0006]反向引物：5’‑TGCCCAAAGGGATCATGGAC‑3’。[0007]第二方面，本发明提供含有SEQIDNO:1‑2所示引物的检测试剂或试剂盒。[0008]第三方面，本发明提供嗜果刀孢菌检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQIDNO:1‑2所示引物，还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。[0009]第四方面，本发明提供SEQIDNO:1‑2所示引物或含有该引物的检测试剂或试剂盒在嗜果刀孢菌检测中的应用。[0010]第五方面，本发明提供嗜果刀孢菌检测方法，包括以下步骤：[0011]1)提取待测样品总DNA；[0012]2)以步骤1)中提取的