链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗体及制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105503689A(43)申请公布日2016.04.20(21)申请号201510956434.3C07K16/14(2006.01)(2006.01)(22)申请日2015.12.17G01N33/53G01N33/531(2006.01)(71)申请人西南大学地址400715重庆市北碚区天生路2号(72)发明人马良张宇昊吴春生钟红(74)专利代理机构北京同恒源知识产权代理有限公司11275代理人赵荣之(51)Int.Cl.C07D207/38(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/795(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗体及制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗体及制备方法和应用，具体公开了一种作为细交链格孢菌酮酸半抗原的化合物(式I)，半抗原TAO与牛血清蛋白和血蓝蛋白等大分子蛋白偶联获得的人工抗原，由该人工抗原制备得到的多克隆抗体以及它们在检测细交链格孢菌酮酸中的应用。本研究通过建立间接竞争ELISA方法可检测TA，为TA免疫学检测方法提供理论依据并为进一步开发检测TA的免疫学速测产品奠定基础，为建立TA的免疫学检测方法、开发TA的免疫学系列产品，快速、高效地监控TA的污染情况提供了又一条新途径。CN105503689ACN105503689A权利要求书1/1页1.作为细交链格孢菌酮酸半抗原的化合物，其特征在于，具有式I所述结构：命名为TAO。2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按质量体积比13:17(mg:mL)的比例将细交链格孢菌酮酸溶于混合溶剂A中，加入过量羧甲基羟胺半盐酸盐，混合均匀后回流加热15h，冷却，减压干燥，加入2M的盐酸溶解，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后减压浓缩得胶状物，将胶状物用二氯甲烷/正己烷重沉淀纯化即得；所述混合溶剂A为甲醇、吡啶和水按体积比为1:4:1的比例混合而得。3.细交链格孢菌酮酸人工抗原，其特征在于，将半抗原TAO与牛血清蛋白偶联获得人工抗原TAO-BSA，或与血蓝蛋白偶联获得人工抗原TAO-KLH。4.权利要求3所述细交链格孢菌酮酸人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按摩尔比为1：1.5～5：5～10的比例称取TAO、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，分别溶解于二甲基甲酰胺后再缓慢滴加混合，室温下避光搅拌16h，4℃冷却2h以上，10000r/min离心5min，得到上清液，将上清液与牛血清蛋白按摩尔比60～80：1，或与血蓝蛋白按摩尔比250～350：1的比例进行偶联，4℃搅拌反应2h后PBS4℃透析纯化。5.细交链格孢菌酮酸抗体，其特征在于，由权利要求1所述作为细交链格孢菌酮酸半抗原的化合物或由权利要求3所述细交链格孢菌酮酸人工抗原制备得到。6.根据权利要求5所述的细交链格孢菌酮酸抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。7.权利要求1所述作为细交链格孢菌酮酸半抗原的化合物、权利要求3所述细交链格孢菌酮酸人工抗原、权利要求5或6所述细交链格孢菌酮酸抗体在检测细交链格孢菌酮酸中的应用。2CN105503689A说明书1/6页链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗体及制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗体及制备方法和应用。背景技术[0002]细交链格孢菌酮酸(Tenuazonicacid，TA)是链格孢霉、稻瘟病霉等霉菌在特定条件下产生的有毒代谢产物之一，在美国、加拿大、巴西、中国等国家均有发现。TA可广泛污染食品及饲料，导致水果、谷物以及蔬菜的采后腐烂，并可寄生、腐生植物体内导致茎点霉病以及水稻稻瘟病等。在目前已知的70多种具有明显毒性的链格孢霉毒素中，TA毒性最强且污染水平居各种链格孢霉毒素之首。TA具有多种生物特性，如通过抑制核糖体的释放抑制蛋白质的合成，抗病毒、抗肿瘤、抑菌性、细胞毒性和植物毒性，并且对哺乳动物(小鼠、大鼠等)也具有急性毒性。但是目前关于TA对人类及动物相关危害的数据相对比较缺乏，包括欧美等发达国家和地区也尚未颁布关于TA毒素的限量标准。[0003]TA的污染水平一般为μg/kg，需要较高水平的检测灵敏度，利用免疫学检测霉菌毒素与仪器方法互补获得较高的检测灵敏度是目前霉菌毒素检测领域研究和应用的热点方法。TA分子结构式为C9H13O3N，分子量较小(M＝197)，本身无法产生免疫原性，通常要对TA进行半抗原修饰和人工抗原的合成研究，才能制备得到免疫抗体继而进一步开发免疫