应用LFD-RPA技术检测菠萝泛菌的引物、探针、试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948581A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211245221.6(22)申请日2022.10.12(71)申请人安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所地址230031安徽省合肥市农科南路40号(72)发明人杨雪徐会永臧昊昱谷春艳潘锐戚仁德(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245专利代理师高宁馨(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称应用LFD-RPA技术检测菠萝泛菌的引物、探针、试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种应用LFD‑RPA技术检测菠萝泛菌的引物、探针、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。所述的引物基于菠萝泛菌的一个假定蛋白Hypotheticalprotein基因序列设计；所述的引物的上游引物Pa‑F序列如SEQIDNo:1所示，所述的引物的下游引物Pa‑R序列如SEQIDNo:2所示，所述的探针Pa‑Probe序列如SEQIDNo:3所示。利用待测样品的研磨液进行LFD‑RPA检测，根据LFD试纸条的条带确定待测样品是否含有菠萝泛菌。该技术摆脱了传统分子检测对专业仪器和专业技术人员的依赖，实现对菠萝泛菌的快速检测。CN115948581ACN115948581A权利要求书1/1页1.一种应用LFD‑RPA技术检测菠萝泛菌的引物和探针，其特征在于：所述的引物基于菠萝泛菌的一个假定蛋白Hypotheticalprotein基因序列设计；所述的引物的上游引物Pa‑F序列如SEQIDNo:1所示，所述的引物的下游引物Pa‑R序列如SEQIDNo:2所示，所述的探针Pa‑Probe序列如SEQIDNo:3所示。2.根据权利要求1所述的应用LFD‑RPA技术检测菠萝泛菌的引物和探针，其特征在于：所述的引物的下游引物Pa‑R的5’端用生物素Biotin标记。3.根据权利要求2所述的应用LFD‑RPA技术检测菠萝泛菌的引物和探针，其特征在于：所述的探针Probe的5’端用异硫氰酸荧光素FITC基团标记，其5’端起第33位与第34位碱基中标记四氢呋喃THF，其3’端用磷酸基团PHO标记。4.一种含有权利要求1‑3任意一项所述的引物和探针的试剂盒。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括LFD试纸条。6.如权利要求1所述的引物和探针在菠萝泛菌检测中的应用。7.如权利要求1所述的引物和探针在制备用于检测菠萝泛菌的产品中的应用。8.如权利要求4所述的试剂盒在菠萝泛菌检测中的应用。9.根据权利要求8所述的试剂盒在菠萝泛菌检测中的应用，其特征在于：其应用的方法，包括以下步骤：利用待测样品的研磨液进行LFD‑RPA检测；根据LFD试纸条的条带确定待测样品是否含有菠萝泛菌。10.根据权利要求9所述的试剂盒在菠萝泛菌检测中的应用，其特征在于：根据LFD试纸条的条带确定待测样品是否含有菠萝泛菌的方法为：如果LFD试纸条出现一条蓝色条带位于质控区内，一条红色条带位于检测区，则结果为阳性，表明待测样品中含有菠萝泛菌；如果LFD试纸条只出现一条蓝色条带，位于质控区内，则结果为阴性，表明待测样品中不含有菠萝泛菌。2CN115948581A说明书1/5页应用LFD‑RPA技术检测菠萝泛菌的引物、探针、试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种应用重组酶聚合酶扩增侧流层技术(LFD‑RPA)快速检测菠萝泛菌的引物、探针、试剂盒及其应用。背景技术[0002]菠萝泛菌（Pantoeaananatis）是一类重要的植物病原细菌，可导致植物产生枯萎、腐烂、叶斑、顶梢枯死等症状。菠萝泛菌可引起水稻、洋葱、甜樱桃、甜瓜、茶树、菠萝、甘蔗等众多大宗作物和经济作物的细菌性病害，并造成严重危害。[0003]传统的细菌性病害的检测速度较慢，且需要PCR仪等高精尖仪器设备，主要适用于实验室内检测，无法满足快速检测的需求，使其应用受到限制。重组酶聚合酶等温扩增技术（recombinaseplolymeraseamplification，RPA）是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术不仅可以摆脱对高值仪器的需求，且反应时间短，通过与荧光基团标记，RPA技术可与侧流层析试纸条(lateralflowdipsticks，LFD)相结合，实现扩增产物的可视化检测，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，可以实现病原物高特异性、高灵敏度的可视化快速检测，具有极为广泛的应用前景。目前尚未有关于应用LFD‑RPA技术检测菠萝泛菌