一种用于同时检测4种病原体的多重PCR的引物组及其检测方法、试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115786587A(43)申请公布日2023.03.14(21)申请号202211379868.8C12R1/385(2006.01)(22)申请日2022.11.04(71)申请人中国农业科学院特产研究所地址130112吉林省长春市净月经济开发区聚业大街4899号(72)发明人唐毓许保增杨镒峰张颖薛海龙(74)专利代理机构北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)11463专利代理师王焕(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/689(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表（电子公布）附图8页(54)发明名称一种用于同时检测4种病原体的多重PCR的引物组及其检测方法、试剂盒(57)摘要本发明提供了一种用于同时检测4种病原体的多重PCR的引物组及其检测方法、试剂盒，涉及生物检测技术领域。本发明研发设计了适用于水貂活体4种常见病原体的核酸快速提取方法以及多重PCR检测的引物组，所述引物组包括分别用于检测水貂犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒和绿脓杆菌的上下游引物。本发明提供的核酸提取方法操作简单、快速、提取效果好；多重PCR检测的引物组、检测体系和检测方法具效率高、灵敏性强、特异性好、重复稳定性好的特点，并且克服了单重PCR的繁琐步骤、操作方便、简单高效，具有开拓性的意义。CN115786587ACN115786587A权利要求书1/1页1.一种用于同时检测4种病原体的多重PCR的引物组，其特征在于，所述病原体为水貂犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒和绿脓杆菌，所述引物组包括：用于犬瘟热病毒检测的上下游引物，序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；用于细小病毒检测的上下游引物，序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示；用于阿留申病毒检测的上下游引物，序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；以及用于绿脓杆菌检测的上下游引物，序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示。2.用于水貂犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒和绿脓杆菌多重PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，优选地，所述试剂盒还包括PCR检测试剂；更优选地，所述PCR检测试剂包括PCR反应缓冲液、反应酶、dNTPs、RNasefreeH2O。4.非疾病诊断目的的水貂犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒和绿脓杆菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括：用权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂盒对PCR模板进行多重PCR扩增反应。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括一个反应体系内同时提取待测样本的总核酸，进行逆转录获得所述PCR模板。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取包括将水貂犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒和绿脓杆菌的混合样品与裂解液混匀后同时水浴孵育，所述裂解液包括90‑110mmoL/L的Tris‑HCL，10‑15mmoL/L的EDTA，0.1‑1.0体积％的NP‑40，0.1‑1.0体积％的Tween20。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，水浴孵育的条件为55‑60℃水浴孵育25‑35min，之后95‑100℃水浴10min以上灭活蛋白酶。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行所述多重PCR时，各引物在扩增体系中的终浓度为0.1‑1μM；优选为0.5‑0.8μM。9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的条退火温度为50‑62℃。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的条件为：94‑95℃预变性8‑10min，94‑95℃变性10‑20s；50‑62℃15‑30s，72℃延伸25‑30s，35‑50个循环。2CN115786587A说明书1/10页一种用于同时检测4种病原体的多重PCR的引物组及其检测方法、试剂盒技术领域[0001]本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及用于一种用于同时检测4种病原体的多重PCR的引物组及其检测方法、试剂盒。背景技术[0002]水貂作为重要的毛皮经济动物之一，自20世纪50年代引种扩繁以来，目前种貂已超过百万只，而做好水貂种群的疾病防疫检疫，及时预防疾病是保证水貂高效健康养殖的关键(王宝等,2009)。随着医学研究的进步，水貂作为动物模型的应用日渐广泛。研究发现，应用水貂建立呕吐模型，有助于抗呕吐机制研究和新药筛选(闫文卓等,2020)。此外，水貂还是人类流感和胚胎着床相关疾病的理想动物模型(Sun等,2021；Fenelon和Murphy,2019)。然而，实