一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115786589A(43)申请公布日2023.03.14(21)申请号202211408917.6(22)申请日2022.11.11(71)申请人青岛农业大学地址266109山东省青岛市城阳区长城路700号(72)发明人李桂梅仇德洋蔺雅婷张芳源单虎(74)专利代理机构北京盛询知识产权代理有限公司11901专利代理师刘静(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用(57)摘要本发明公开了一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用，属于病毒检测领域。引物和探针包括：PoRVF2如SEQIDNO：3所示，PoRVR如SEQIDNO：2所示，PoRVPro如SEQIDNO：9所示；其中，所述PoRVPro的5'端标记荧光基团，所述PoRVPro的第31位碱基替换为四氢呋喃，3'末端标记聚合酶延伸阻断基团。本发明能高灵敏度、特异性检测猪轮状病毒，并且具备成本低、便于携带、不受实验室仪器限制可以现场检测，适合应用于基层人员和偏远地区在猪轮状病毒快速检测中。CN115786589ACN115786589A权利要求书1/1页1.一组检测猪轮状病毒的引物和探针，其特征在于，包括：PoRVF2：5'‑ATTGTATCTAAAGGTATAGCAGTGACGGAG‑3'；PoRVR：5'‑AAATGATACTGGCTTTTGTAGCATGGTTAA‑3'；PoRVPro：5'‑CGCAAAATTGAATTCGTACGCACCAGTTTTATTTAGAGAAACGTCGT‑3'；其中，所述PoRVPro的5'端标记荧光基团，所述PoRVPro的第31位碱基替换为四氢呋喃，所述PoRVPro的3'端标记聚合酶延伸阻断基团。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM基团；所述聚合酶延伸阻断基团包括C3‑Spacer。3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述PoRVR的5'端用生物素标记。4.一种检测或诊断猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1‑3任一项所述的引物和探针。5.如权利要求1‑3任一项所述的引物和探针的应用，其特征在于，包括如下任一项：(1)在制备检测猪轮状病毒的试剂盒中的应用；(2)在制备诊断猪轮状病毒感染情况的试剂盒中的应用。6.一种非疾病诊断目的的检测猪轮状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的RNA或DNA为模板，利用权利要求1‑3任一项所述的引物和探针扩增，通过扩增产物判定是否为猪轮状病毒。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增反应体系包括：PoRVF22μL、PoRVR2μL、PoRVPro0.6μL、RNA模板5μL，补充至50μL。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增反应程序为：37℃孵育反应15min。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测包括电泳检测或者侧层析试纸条检测。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，采用侧流层析检测时，若试纸条出现两条红色的带，一条位于质控区，一条位于检测区，表明待测样品中含有猪轮状病毒或达到了试纸条的最低检出量；若试纸条质控区出现一条红色带，检测区没有条带，表明待测样品中不含有猪轮状病毒或低于试纸条最低检出量；若试纸条质控区和检测区均未出现条带，说明使用的试纸条或者扩增试剂损坏、失效或者操作有误。2CN115786589A说明书1/7页一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用技术领域[0001]本发明涉及病毒检测领域，特别是涉及一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用。背景技术[0002]猪轮状病毒(porcinerotavirous,PoRV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属、基因组双链RNA病毒，病毒包含11段双链RNA，基因全长为18.2kbp编码6种结构蛋白(VP1‑VP4,VP6和VP7)和5种非结构蛋白(NSP1‑NSP5)。病毒粒子有3层衣壳，呈20面体对称。病毒粒子的11种蛋白，VVP4、VP6和VP7决定着病毒的感染性和免疫性；VP1、VP2、VP3与NSP2、NSP4、NSP5是RNA结合蛋白，其与基因复制、合成表达相关；VP1、VP2、VP3是病毒核心蛋白。[0003]现有技术中分离鉴定病毒的方法有多种，如：[0004]PoRV病毒分离鉴定：采集24h之内的小肠或者粪便，利用细胞培养系培养传代分离病毒、接种增殖，一般选用PK细胞或ST细胞系，使用免疫荧光或者PCR方法进行鉴定。该方法缺点是费时费力，试验周期较长、操作复杂，