同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927763A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211741366.5(22)申请日2022.12.31(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人吴斌宋文博冯逸雪彭忠华琳汤细彪(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所(普通合伙)42001专利代理师张红兵(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表（电子公布）附图9页(54)发明名称同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用(57)摘要本发明属于动物病毒学分子技术领域，具体涉及同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用。本发明针对猪轮状病毒核酸血清型的多样性，设计了针对不同血清型的探针组合物如A型，B型，C型和H型基因的探针引物。各探针标记了荧光基团且荧光基团彼此互不相同且互不干扰，组合物以混合的形式存在。其中：A型探针PoRVA‑P的5’端用FAM修饰；3’端用BHQ1修饰；B型探针PoRVB‑P的5’端用ROX修饰，3’端用MGB修饰；C型探针PoRVC‑P的5’端用HEX修饰，3’端用BHQ1修饰；H型探针PoRVH‑P的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰。本发明灵敏度高、特异性强、操作简单方便。CN115927763ACN115927763A权利要求书1/2页1.同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量组合物，其特征在于，所述组合物包括猪轮状病毒A型引物和探针序列,B型引物和探针序列,C型引物和探针序列以及H型引物和探针序列：猪轮状病毒A型引物和探针序列：PoRVA‑FTGAATCGTCTTCTACAACGTCAAC(SEQIDNO：1)PoRVA‑RTCGTTTGAAGCAGAATCAGATGG(SEQIDNO：2)PoRVA‑PCTCTGGAGACTTCGACAACAT(探针序列SEQIDNO：3)猪轮状病毒B型引物和探针序列；PoRVB‑FGGATTAAATAR(A/G)CCCAACY(C/T)GR(A/G)CG(SEQIDNO：4)；其中R，Y，R为突变；PoRVB‑RTTB(G/T/C)AGATTY(C/T)GTR(A/G)TTTGGN(A/T/C/G)GCTA(SEQIDNO：5)；其中B，Y，R，N为突变；PoRVB‑PAGCATGGATCTGATY(C/T)GAAACAGT(探针序列SEQIDNO：6)；其中Y为突变；猪轮状病毒C型引物和探针序列；PoRVC‑FCATGTAGCATGAK(G/T)TCACGAATGGG(SEQIDNO：7)；其中K为突变；PoRVC‑RACATTTCATCCTCCTGGGGATC(SEQIDNO：8)；PoRVC‑PGCGTAGGGGCAAATGCGCATGA(探针序列SEQIDNO：9)；猪轮状病毒H型引物和探针序列：PoRVH‑FACTTCAATCGTTGCTGCAACAG(SEQIDNO：10)；PoRVH‑RTY(C/T)CTTTTGCTTCTGAGATCAAATCG(SEQIDNO：11)；其中Y为突变；PoRVH‑PTCGCTCATCCTAAGGCAAGAGGTATCCA(探针序列SEQIDNO：12)。2.根据权利要求1所述的同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量检测组合物，其特征在于，所述检测引物探针组合物中的各探针标记了荧光基团且荧光基团彼此互不相同且互不干扰；所述组合物以混合的形式存在；所述猪轮状病毒A型探针序列PoRVA‑P的5’端用FAM修饰；3’端用BHQ1修饰；所述猪轮状病毒B型探针序列PoRVB‑P的5’端用ROX修饰，3’端用MGB修饰；所述猪轮状病毒C型探针序列PoRVC‑P的5’端用HEX修饰，3’端用BHQ1修饰；所述猪轮状病毒H型探针序列PoRVH‑P的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰。3.权利要求1或2核酸荧光定量检测组合物在制备同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的荧光定量试剂盒中的应用。4.同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如权利要求1或2所述的猪轮状病毒检测引物和探针组合。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含有PCR预混液、酶预混液、无RNA酶水、阳性对照和阴性对照。6.一种用于非治疗和非诊断目的A、B、C和H型猪轮状病毒病毒的核酸荧光定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)提取或释放待测样本的核酸；2CN115927763A