一种牛副结核病间接ELISA检测试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115902217A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202310215284.5(22)申请日2023.03.08(71)申请人中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）地址150069黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号(72)发明人刘思国党光辉陈利苹李田田(74)专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139专利代理师马鑫(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/58(2006.01)权利要求书1页说明书24页附图7页(54)发明名称一种牛副结核病间接ELISA检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种牛副结核病间接ELISA检测试剂盒及其应用。本发明属于微生物检测技术领域。本发明成功筛选出具有良好抗原性的包被原，同时应用该抗原建立了牛副结核病间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。本发明通过对100份MAP阳性血清的检测，得出本发明方法的敏感性为93.0%。通过对200份MAP阴性血清的检测得出本发明方法的特异性为95.5%，明显高于其他检测方法。总之，本发明建立的牛副结核病间接ELISA检测的方法具有快速准确，敏感性和特异性高的特点。本发明的提出为预防和清除牛副结核病，保护我国畜牧业健康快速的发展提供了技术支撑。CN115902217ACN115902217A权利要求书1/1页1.一种牛副结核病（Paratuberculosis，PTB）间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）的培养滤液包被的酶标板，其中所述的禽分枝杆菌副结核亚种的培养滤液是通过以下方法制备得到的：（1）将包含109CFU/mL的禽分枝杆菌副结核亚种接种至含有0.05%v/vTween‑80、0.2%v/v甘油、5mM天冬酰胺以及10%v/v的自制ADC的7H9培养基中，37℃恒温160rpm培养10周，收集菌液；其中，所述的自制ADC是通过以下方法制备得到：NaCl8.5g，右旋‑Dextrose20.0g，过氧化氢酶0.03g，定容到1L，0.22µm滤器过滤除菌；（2）将收集到的菌液进行离心，上清用0.22μm孔径的滤膜过滤后为培养滤液。2.如权利要求1所述的牛副结核病（Paratuberculosis，PTB）间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，培养滤液包被酶标板的浓度为50μg/mL。3.如权利要求1所述的牛副结核病（Paratuberculosis，PTB）间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，步骤（2）中所述的离心是指10000rpm4℃离心30min。4.如权利要求1所述的牛副结核病（Paratuberculosis，PTB）间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括用于血清抗体中非特异性因素吸附的草分枝杆菌（Mycobacteriumphlei）的培养滤液、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液、浓缩洗涤液、HRP标记后的兔抗牛IgG抗体、显色液以及终止液。5.如权利要求4所述的牛副结核病（Paratuberculosis，PTB）间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的包被缓冲液为20mmol/LTris‑HCl缓冲液，样品稀释液为PBST，所述的封闭液为1%v/v脱脂乳+5%v/v猪血清，所述的浓缩洗涤液为25×PBST，所述的显色液为TMB显色液，所述的终止液为0.05%v/v的氢氟酸。6.权利要求1‑5任一项所述的牛副结核病间接ELISA检测试剂盒在制备检测或者诊断牛副结核病的试剂中的用途。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的试剂为间接ELISA检测试剂。2CN115902217A说明书1/24页一种牛副结核病间接ELISA检测试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种牛副结核病间接ELISA检测试剂盒及其应用。本发明属于微生物检测技术领域。背景技术[0002]禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）是副结核病（Paratuberculosis，PTB）或约内氏病（Johne’sdisease，JD）的病原菌，PTB是一种进行性、感染性、肉芽肿性的慢性肠炎，宿主范围主要为反刍动物，特别是奶牛和各种驯养动物。上世纪初，由于交通工具的发达使得动物可以在世界各地移动，导致PTB在全球开始流行，在大多数重要的乳制品生产国，奶牛中MAP感染的群体流行率超过50％，感染副结核的病牛不适用于育种，同时病牛的出售极易感染其他牛群，造成不可挽回的损失，对全球的经