一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115894716A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211470829.9(22)申请日2022.11.23(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人崔旻刘威(74)专利代理机构武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙)42231专利代理师徐绍新(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/866(2006.01)C12N5/10(2006.01)A61K39/245(2006.01)A61P31/22(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，本发明还公开了重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法及其在制备抗FHV‑I疫苗中的应用，通过分子克隆技术将gD+Ls基因克隆到PfastbacⅠ穿梭载体后利用昆虫‑杆状病毒真核表达系统进行蛋白的表达，制备的纳米颗粒具有组装正确，粒径合适，大小分明且具有良好免疫原性，可以诱导机体产生较高的抗体水平。CN115894716ACN115894716A权利要求书1/1页1.一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.编码权利要求1所述重组融合蛋白纳米颗粒的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.权利要求1或2所述重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1、设计引物，扩增核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的DNA片段；S2、将得到的DNA片段连接到杆状病毒表达载体，构建重组杆粒；S3、用重组杆粒转染昆虫细胞，经传代培养，蛋白表达后得到高表达目的蛋白的昆虫细胞；S4、琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述引物序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述杆状病毒表达载体为PfastbacI。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述昆虫细胞为SF9细胞。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：S3中，将转染后的昆虫细胞传代培养至P4代，用MOI＝10的病毒量感染昆虫细胞96h，得到高表达目的蛋白的昆虫细胞。8.权利要求1所述的重组融合蛋白纳米颗粒在制备抗FHV‑I疫苗中的应用，该疫苗具有免疫原性，可以诱导机体产生中和抗体。2CN115894716A说明书1/9页一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法技术领域[0001]本发明属于疫苗领域，具体涉及一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，本发明还涉及重组融合蛋白纳米颗粒的制备及其在制备抗FHV‑I疫苗中的应用。背景技术[0002]猫传染性鼻支气管炎的病原体为猫疱疹病毒I型(FHV‑I)，属于疱疹病科甲型疱疹病毒亚科，属于传染性极强的恶性传染病，以上呼吸道感染为主要临床症状，宿主为猫和猫科动物，未接种疫苗的幼猫感染后发病率为100％，成年猫感染后一般不致死，但愈后不良，重症病例可见角膜、鼻甲骨造成永久性损伤。[0003]目前国内对于该疾病的预防还是依赖于注射美国辉瑞公司生产的“妙三多”宠物疫苗，而国内本土商业化的猫疱疹病毒疫苗目前还是空白，随着国内宠物猫FHV‑1感染病例和分离出感染病毒株多样性的不断增加以及进口“妙三多”疫苗供不应求且不适应本地毒株出现的疫苗保护性下降的问题，着手研制一种可用于预防猫疱疹病毒感染的生物制剂就显得十分重要。[0004]本发明将已经由国内外文献报道的具有病毒中和作用的猫疱疹病毒粒子表面囊膜糖蛋白gD与可以在体内自发组装成60聚体纳米颗粒的Lumazine合酶(LumazineSynthase，Ls)进行融合表达，制备成多聚体蛋白质纳米颗粒。本发明通过真核表达系统表达和纯化出的纳米颗粒具有蛋白表达产量高、生产周期短且操作简单易于放大生产的优点，经验证其蛋白结构折叠正确、具有生物活性，可以为猫疱疹病毒亚单位疫苗的研制提供一种全新且高效的选择方案。发明内容[0005]本发明的第一个目的是提供一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，编码所述重组融合蛋白纳米颗粒的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。[0006]本发明选择具有60个亚基的Ls作为载体，其抗原展示表位丰富，末端靠近对称轴可以稳定三聚体或五聚体抗原的呈递，以确保膜蛋白免疫原的充分暴露。又对病毒gD糖蛋白的氨基酸全长进行了序列分析