重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948452A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202210930894.9C40B40/06(2006.01)(22)申请日2022.08.04(71)申请人中国农业科学院农业基因组研究所地址518000广东省深圳市大鹏新区鹏飞路7号B5栋(72)发明人李盛本陈月(74)专利代理机构北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)11463专利代理师刘桐亚(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/113(2010.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用(57)摘要本发明提供了一种重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的重组质粒，包括第一表达单元和第二表达单元，其中，第二表达单元从5’至3’依次包括第二启动子和miRNA173编码序列；第一表达单元从5’至3’依次包括第一启动子和TAS1c基因，TAS1c基因中产生成熟tasiRNA的序列替换为ccdB基因，ccdB基因5’端和3’端分别设置酶切位点。采用酶切方法将该重组质粒中的ccdB基因替换为小RNA表达序列，产生的小RNA与内源反式作用小RNA类似、长度为21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA，并可以高效对靶基因进行表达调控。CN115948452ACN115948452A权利要求书1/1页1.一种重组质粒，其特征在于，包括第一表达单元和第二表达单元；所述第一表达单元从5’至3’依次包括以下元件：第一启动子和TAS1c基因，所述TAS1c基因中产生成熟tasiRNA的序列替换为ccdB基因，所述ccdB基因5’端和3’端分别设置酶切位点；所述第二表达单元从5’至3’依次包括以下元件：第二启动子和miRNA173编码序列。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述第一启动子包括Ubi、ACT或35S启动子；所述第二启动子包括Ubi、ACT或35S启动子。3.一种小RNA随机过表达质粒文库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：a.提取植物中的小RNA，添加特异接头，然后反转录得到cDNA，再经过PCR扩增后获得DNA文库；b.分别酶切权利要求1或2所述的重组质粒和a步骤获得的DNA文库，连接后建立得到ccdB基因替换为小RNA编码序列的小RNA随机过表达质粒文库。4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述植物包括玉米、水稻、油菜或烟草；优选地，a步骤中，提取小RNA的方法还包括采用AGO1抗体进行免疫沉淀的步骤；优选地，所述小RNA的大小为20‑25nt。5.一种小RNA随机过表达质粒文库，其特征在于，采用权利要求3或4所述的建立方法建立得到。6.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求5所述的小RNA随机过表达质粒文库在植物内源小RNA功能高通量研究中的应用。7.一种植物内源小RNA功能高通量研究的方法，其特征在于，包括如下步骤：c.将权利要求5所述的小RNA随机过表达质粒文库转染植物，获得不同性状的植株；d.根据植株性状，获得植株中过表达小RNA的功能。8.miR319a‑3p在调控植物分蘖中的应用。9.一种小RNA，其特征在于，所述小RNA的核酸序列如SEQIDNO.1所示。10.权利要求9所述小RNA在调控植物育性或结实率中的应用。2CN115948452A说明书1/9页重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用。背景技术[0002]RNA具有丰富的多样性，在整个生命进程中发挥着各种各样的功能。根据RNA编码蛋白质的功能有无，可分为信使RNA(messengerRNA，mRNA)和非编码RNA(non‑codingRNA,ncRNA)，小RNA是一类非常重要的ncRNA。小RNA无开放阅读框，但在调节细胞生长和分化的过程中扮演着非常重要的角色，主要通过转录后调控改变靶基因的表达来影响生物体的生长发育和生理代谢，有重要的基因表达调控功能，代表了新的基因表达调控的方式。小RNA参与植物的几乎所有生长发育过程，如种子萌发、根系和叶片发育、花器官的形态建成、生殖、激素信号传导、细胞代谢、诱导器官分化和性别决定等，同时在植物抗病时发挥作用，还能介导植物对干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的抗性，是植物正常生长发育所必需的。[0003]水稻和玉米作为世界上最主要的粮食作物，世界上一半以上的人口以水稻和玉米为食，