一种重组表达质粒、转化子及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108611357A(43)申请公布日2018.10.02(21)申请号201611147437.3(22)申请日2016.12.13(71)申请人上海凯赛生物技术研发中心有限公司地址200120上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路1690号5号楼申请人凯赛生物产业有限公司(72)发明人庞振华周豪宏刘修才(51)Int.Cl.C12N15/63(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N9/88(2006.01)C12P13/00(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表6页附图5页(54)发明名称一种重组表达质粒、转化子及其应用(57)摘要本发明涉及一种重组表达质粒，还涉及一种含有重组表达质粒的转化子。一种含有重组表达质粒的转化子，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。本发明还涉及该转化子在发酵生产L-赖氨酸脱羧酶及发酵生产1,5-戊二胺方面的应用。本发明解决了现在重组质粒在连续传代中出现不稳定的问题。CN108611357ACN108611357A权利要求书1/2页1.一种重组表达质粒，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，其特征在于，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的热不稳定阻遏蛋白包括：热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI、热不稳定突变型阻遏蛋白TetR或热不稳定突变型阻遏蛋白LacI；进一步优选地，所述的热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI包括CI857，I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E。3.根据权利要求2所述的重组表达质粒，其特征在于，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI调控的启动子是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工构建的启动子；进一步优选地，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI调控的启动子为来源于λ噬菌体基因组的L启动子、R启动子、L启动子的突变型、R启动子的突变型。4.根据权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的多肽包括酶或多肽类药物；进一步优选地，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，又更进一步，所述氨基酸脱羧酶包括赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括如SEQIDNO:1所示的DNA序列、如SEQIDNO:2所示的DNA序列，如SEQIDNO:3所示的DNA序列，如SEQIDNO:1所示序列的片段，如SEQIDNO:2所示序列的片段或如SEQIDNO:3所示序列的片段。6.一种含有重组表达质粒的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌；所述重组表达质粒如权利要求1-5任一项所述。7.如权利要求6所述的含有重组表达质粒的转化子，其特征在于，所述重组表达质粒如权利要求5任一项技术方案所述。8.根据权利要求6或7中所述的含有重组表达质粒的转化子，其特征在于：所述的宿主菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，或者所述的宿主菌是有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌。9.根据权利要求6-8任一项所述的含有重组表达质粒的转化子，其特征在于，所述转化子中含有编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI的聚核苷酸。10.根据权利要求9所述的含有重组表达质粒的转化子，其特征在于，所述编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI的聚核苷酸位于质粒上，进一步优选地，所述编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI的聚核苷酸在所述温控重组表达质粒上；或者，所述编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI的聚核苷酸位于宿主基因组中。11.一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：A)培养权利要求6～10任一项所述的转化子；B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。12.如权利要求11所述的一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：2CN108611357A权利要求书2/2页1)培养如权利要求7-10任一项所述的转化子；2)从步骤