双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107090466A(43)申请公布日2017.08.25(21)申请号201710262042.6C40B50/06(2006.01)(22)申请日2017.04.20(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区北京市100084信箱82分箱清华大学专利办公室申请人北京合生基因科技有限公司(72)发明人谢震马大程(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华(51)Int.Cl.C12N15/66(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/63(2006.01)C40B40/06(2006.01)权利要求书7页说明书14页序列表20页附图2页(54)发明名称双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法(57)摘要本发明公开了一种双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法。本发明所提供的方法一是利用两轮goldengate拼装技术，将预先设计在寡核苷酸上的编码双sgRNA中的间隔RNA的DNA片段插入到载体中；方法二是利用三轮goldengate拼装技术构建随机双敲除sgRNA表达质粒文库。本发明所提供的构建双sgRNA表达质粒文库的方法与现有方法相比，操作更加简便且大大缩短了构建时间。本发明对于鉴定非编码区基因的生物学功能以及鉴定基因与基因的相互作用具有重要意义。CN107090466ACN107090466A权利要求书1/7页1.一种构建双sgRNA表达载体的方法，包括：(a1)利用goldengate拼装方法，采用IIs型限制性内切酶A、IIs型限制性内切酶E、IIs型限制性内切酶D和IIs型限制性内切酶F将DNA片段与出发载体1进行拼装，得到重组载体1；所述DNA片段的序列自上游到下游依次含有：所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、名称为sgRNA1的sgRNA的间隔RNA的编码序列、IIs型限制性内切酶B的识别序列、IIs型限制性内切酶C的识别序列、名称为sgRNA2的sgRNA的间隔RNA的编码序列、所述IIs型限制性内切酶D的识别序列；所述出发载体1的序列自上游到下游依次含有启动子1序列、所述IIs型限制性内切酶E的识别序列、筛选标签1的编码序列、所述IIs型限制性内切酶F的识别序列、sgRNA骨架1编码序列；所述DNA片段与所述出发载体1中，所述IIs型限制性内切酶A切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶E切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶D切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶F切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶A切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶E切割产生的粘性末端overhang均不与所述IIs型限制性内切酶D切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶F切割产生的粘性末端overhang互补配对；(a2)利用goldengate拼装方法，采用IIs型限制性内切酶G、所述IIs型限制性内切酶B、IIs型限制性内切酶H和所述IIs型限制性内切酶C将所述重组载体1与出发载体2进行拼装，得到重组载体2，所述重组载体2即为所述双sgRNA表达载体；所述出发载体2的序列自上游到下游依次含有：所述IIs型限制性内切酶G的识别序列、sgRNA骨架2编码序列、筛选标签2的编码序列、启动子2序列、所述IIs型限制性内切酶H的识别序列；所述重组载体1与所述出发载体2中，所述IIs型限制性内切酶G切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶B切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶H切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶C切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶G切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶B切割产生的粘性末端overhang均不与所述IIs型限制性内切酶H切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶C切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶A、所述IIs型限制性内切酶D、所述IIs型限制性内切酶E和所述IIs型限制性内切酶F均不同于所述IIs型限制性内切酶B和所述IIs型限制性内切酶C。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述IIs型限制性内切酶A、所述IIs型限制性内切酶D、所述IIs型限制性内切酶E和所述IIs型限制性内切酶F相同；和/或，所述IIs型限制性内切酶B、所述IIs型限制性内切酶C、所述IIs型限制性内切酶G和所述IIs型限制性内切酶H相同；和/或，所述sgR