一种重组质粒、重组质粒制备方法、重组杆粒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110423780A(43)申请公布日2019.11.08(21)申请号201910637354.XA61K39/12(2006.01)(22)申请日2019.07.15A61P31/14(2006.01)G01N33/569(2006.01)(71)申请人新乡学院地址453003河南省新乡市金穗大道东段191号(72)发明人王选年朱艳平申一兰何勇岳锋刘佳李鹏孙国鹏张艳芳(74)专利代理机构北京中建联合知识产权代理事务所(普通合伙)11004代理人旦帅男王灵灵(51)Int.Cl.C12N15/866(2006.01)C12N7/01(2006.01)C12N15/40(2006.01)权利要求书1页说明书17页序列表2页附图10页(54)发明名称一种重组质粒、重组质粒制备方法、重组杆粒及其应用(57)摘要一种重组质粒、重组质粒制备方法、重组杆粒及其应用，所述重组质粒基因组整合了IBDVVP2成熟蛋白的基因序列、GP67蜂毒信号肽基因、His标签蛋白基因序列和终止密码子，且保持了IBDV的开放阅读框编码基因和GP67蜂毒信号肽基因各自的生物学功能；所述VP2成熟蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示序列；所述GP67蜂毒信号肽基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示序列；所述His标签蛋白基因序列如SEQIDNO.3所示序列。本发明在VP2蛋白基因前面加了一个有利于病毒蛋白表达的蜂毒信号肽GP67，外源蛋白出核后昆虫细胞（Sf9）自身的酶会自动将其切下从而与外源蛋白分离开，不会影响外源蛋白的表达，提高VP2蛋白的胞外表达量。CN110423780ACN110423780A权利要求书1/1页1.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒基因组整合了IBDVVP2成熟蛋白的基因序列、GP67蜂毒信号肽基因、His标签蛋白基因序列和终止密码子，且保持了IBDVVP2成熟蛋白的开放阅读框编码基因和GP67蜂毒信号肽基因各自的生物学功能。2.如权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于：所述VP2成熟蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示序列；所述GP67蜂毒信号肽基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示序列；所述His标签蛋白基因序列如SEQIDNO.3所示序列。3.如权利要求1或2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于：由质粒pFastbac1载体质粒在其BamH和EcoR酶切位点酶切位点间插入SEQIDNO.2所示序列得到pFastbac1-GP67重组质粒，之后在pFastbac1-GP67重组质粒的Kpn和EcoR酶切位点间插入SEQIDNO.1所示序列获得pFastbac1-GP67-VP2重组质粒。4.如权利要求3所述的重组质粒的制备方法，其特征在于：所述His标签蛋白基因序列位于合成所述VP2蛋白编码基因的下游引物的3'端中。5.一种重组杆粒，其特征在于：由权利要求4所述pFastbac1-GP67-VP2重组质粒转化E.coliDH10Bac感受态细胞获得rBacmid-VP2重组杆粒。6.如权利要求5所述的一种重组杆粒的应用，其特征在于，包括以下步骤：1）将rBacmid-VP2重组杆粒采用脂质体转染法转染至Sf9细胞中获得重组杆状病毒，；2）对获得的重组杆状病毒进行多次扩增，以获得高滴度高感染力的重组杆状病毒，用重组杆状病毒感染大量sf9细胞以量产化获得重组蛋白；3）将所述重组蛋白保存至蛋白保存液中为后续生产提供原材料，所述蛋白保存液中含有10mMCaCl2和Tris-Hcl溶液。7.如权利要求6所述的一种重组杆粒的应用，其特征在于，所述重组蛋白用于生产亚单位疫苗。8.如权利要求6所述的一种重组杆粒的应用，其特征在于，所述重组蛋白用于生产ELISA试剂盒和免疫胶体金检测试纸条。2CN110423780A说明书1/17页一种重组质粒、重组质粒制备方法、重组杆粒及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体属于一种重组质粒、重组质粒制备方法、重组杆粒及其应用。背景技术[0002]IBDV(鸡传染性法氏囊病病毒)属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属，呈二十面体立体对称。IBDV基因组由A，B两个片段dsRNA组成。片段A包含两个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)：大ORF编码VP2、VP3、VP4蛋白基因，小ORF编码VP5蛋白。片段B仅编码VP1蛋白。[0003]VP2蛋白是由A片段基因组编码的50ku左右的IBDV结构蛋白。VP2蛋白基因是控制IBDV毒力的主要基因。VP2包含IBDV的多个重要中和性抗原表位，能诱导细胞产生中和抗体，同时在病毒毒力、细胞嗜性、抗原识别、细胞凋亡等方面起重要作用。发明