表达IBV S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103627718103627718A(43)申请公布日2014.03.12(21)申请号201310470341.0(22)申请日2013.10.10(71)申请人广西大学地址530004广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号(72)发明人韦平李孟何坤(74)专利代理机构广西南宁公平专利事务所有限责任公司45104代理人杨立华(51)Int.Cl.C12N15/63(2006.01)C12N15/66(2006.01)A61K48/00(2006.01)A61P31/14(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书6页说明书6页序列表5页序列表5页附图1页附图1页(54)发明名称表达IBVS1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用，发明人根据GenBank中注册的鸡传染性支气管炎病毒S1、N和Ub基因序列设计引物，通过PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX-YL5株的S1、N和鸡的Ub基因，并用分子生物学方法将鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX-YL5株N和S1基因与鸡Ub基因插入真核表达载体pVAX1中，构建了表达N和S1基因与鸡Ub基因共表达质粒，研制了DNA疫苗pVAX1-Ub-linker-N-S1。实验证明，该疫苗预防IBV疗效显著。应用本发明可同时将IBV的S1、N和鸡Ub基因串联插入pVAX1载体，用于预防鸡传染性支气管炎。CN103627718ACN1036278ACN103627718A权利要求书1/1页1.一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，其特征在于主要由鸡传染性支气管炎病毒的S1、N基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。2.根据权利要求1所述的表达IBVS1和N双抗原蛋白重组质粒，其特征在于：所述Ub基因通过一段编码（G3S）4多肽的linker与将鸡的Ub基因与S1和N基因连接。3.根据权利要求2所述的表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。4.根据权利要求3所述的表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，其特征在于：所述鸡传染性支气管炎病毒来自中国分离株GX-YL5株。5.根据权利要求1所述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒的构建方法，其特征在于用PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒的S1、N和鸡的Ub基因，将鸡的Ub基因与鸡传染性支气管炎病毒的S1和N基因通过引入一段编码（G3S）4多肽的linker采用酶切位点相连的方法连接并将PCR产物经HindIII和XhoI双酶切定向插入以HindIII和XhoI双酶切处理的真核表达载体pVAX1中，即得Ub介导的鸡传染性支气管炎病毒的S1和N基因真核表达质粒pVAX1-Ub-linker-N-S1。6.权利要求1所述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒在制备预防鸡传染性支气管炎DNA疫苗方面的应用。2CN103627718A说明书1/6页表达IBVS1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于动物医药生物工程研究领域，尤其涉及一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用。背景技术[0002]鸡传染性支气管炎（infectiousbronchitis，IB）为国际兽医局及我国规定的家禽二类传染病之一，是目前分布最广泛、发病最普遍的疫病之一。该病是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病，不同日龄、性别、品种鸡均可易感。IBV主要侵害鸡的呼吸道、肠道、输卵管及肾脏，可引起相应器官的病变和损伤，更重要的是容易引起细菌及其它病原的继发感染，引起更大的损失，是造成目前生产上最普遍而且危害最大的鸡呼吸道综合症的重要病因之一。由于IBV在鸡群中感染的广泛性和普遍性，加之病毒基因组RNA复制过程的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制，造成其基因组十分容易发生点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组，使得病毒的血清型、基因型、致病性、免疫原性等极易发生变异，因而病毒临床表现复杂、血清型众多，而各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，从而给本病的免疫防控带来很大的困难。[0003]IBV有三个主要结构蛋白，即纤突（S）蛋白、膜（M）蛋白、核衣壳（N）蛋白。S蛋白由S1和S2两个糖蛋白亚基组成，其中S1糖蛋白是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白，系IBV的主要保护性抗原和致病相关基因，IBV的抗原性和致病性的改变主要与S1基因的变异有关。S1基因5'端起始密码后第159～444nt处存在一个高变区（HVR